超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱法测定中成药及保健食品中非法添加的15种抗组胺类化学成分

张崇生，倪赞，叶建晨，吴大升，刘萌（温州市食品药品检验科学研究院，浙江 温州 325008）

世界变态反应组织（World Allergy Organization，WAO）统计表明，过去30年间，变态反应性疾病如过敏性哮喘、变应性鼻炎、慢性荨麻疹和皮肤瘙痒症等发病率增长了3倍，患病率达22%[1]，主要由多种炎症细胞在变应原的刺激下诱发，具有易发、复发和多慢性的特点。其中肥大细胞及其释放的组胺在变态反应性疾病发生发展过程中发挥重要作用[2]，因此在变态反应性疾病的治疗中，组胺及其受体是重要的治疗靶点，抗组胺药物也被WAO纳入一线诊疗推荐方案。中成药及保健食品不良反应小，可长期服用，尤其契合变态反应性疾病慢性治疗和调理的特点，因此备受人们青睐。不法分子迎合需要，在标称止咳平喘、抗过敏、镇静安神、主治变应性鼻炎和皮肤病等中成药及保健食品非法添加抗组胺类化学成分，达到用量小和见效快的目的，牟取暴利[3]。人们在不知情的情况下长期过量服用添加此类药物的中成药及保健食品，会引发嗜睡、口干、呼吸抑制、眼压升高、过敏性休克、心脏毒性和致畸等不良反应[4-7]。

目前中成药及保健食品中非法添加化学药的行为已受到人们广泛关注，但是对非法添加抗组胺类化学成分的研究报道较少，主要采用液相色谱法[8]，但其分离费时费力，灵敏度低。国内外报道发现抗组胺药物已达40余种，按功能及作用机制可分为第一、二和三代[9]，现有文献同时分析种类最多为7种，且多集中于第一代抗组胺药物[10]。本实验选择临床常用的分属一、二、三代的15种抗组胺类化学成分为目标物，采用超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱（UPLC-MS/MS），以多离子反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）为检测模式，快速检测中成药以及保健食品中非法添加的抗组胺类化学成分，该法灵敏度高、准确度好和选择性强，可以消除中成药以及保健食品等复杂基质干扰，大大提高检测效率，为新形势下的药品和保健品监管提供了强有力的技术保障。

1 材料

Agilent 1290 InfinityⅡ超高效液相色谱仪，Agilent 6495 Triple Quad质谱仪，配Masshunter工作站（美国安捷伦公司）；XS205DU十万分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SB-5200D 超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Milli-Q Integral 5超纯水器（德国密理博公司）。

对照品地氯雷他定（批号：100919-201904）、马来酸氯苯那敏（批号：100047-201507）、阿司咪唑（批号：100301-199901）、盐酸苯海拉明（批号：100066-200807）、盐酸异丙嗪（批号：100422-201603）、盐酸羟嗪（批号：100266-200201）、奋乃静（批号：100133-200602）、盐酸西替利嗪（批号：100660-201803）、盐酸氟奋乃静（批号：100162-201604）、盐酸氯丙嗪（批号：100460-201302）、氯雷他定（批号：100615-201404）、特非那定（批号：100292-201302）、盐酸赛庚啶（批号：100502-201802）（中国食品药品检定研究院），盐酸曲吡那敏（批号：G981254）和马来酸溴苯那敏（批号：G155522）（Laboratory of the Government Chemist公司）。53批样品主要来源为2014－2020年国家保健食品安全风险监测抽样和市县食药监局联合公安部门打四非专项行动抽样，部分通过互联网以及微商购买。试剂甲醇（美国Merck公司）、甲酸和甲酸铵（阿拉丁公司）为色谱纯，水由密理博公司超纯水器制得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：A为0.1%甲酸-10 mmol·L－1甲酸铵，B为甲醇，梯度程序：0～1.5 min，50%A；1.5～3.0 min，50%～35%A；3.0～10.0 min，35%～0%A；10.0～11.0 min，0%A；11.0～11.1 min，0%～50%A；11.1～13.0 min，50%A；柱温：35℃；进样量：2 μL；流速：0.3 mL·min－1。

2.2 质谱条件

离子源：AJS电喷雾离子源，正离子模式（ESI＋）；扫描方式：多反应监测（MRM）；雾化器压力：30 psi；干燥气流速：17 L·min－1，干燥器温度：200℃；鞘气流速：11 L·min－1，鞘气温度：350℃；毛细管电压：4000 V；喷嘴电压：0 V；碎裂电压：380 V。优化后的质谱参数见表1，典型的总离子流图见图1。

表1 15种抗组胺类化学成分的保留时间和质谱参数Tab 1 Retention time and mass spectrometry parameters of 15 antihistamine agents

图1 15种抗组胺类化学成分总离子流图（峰号见表1）Fig 1 Total ion chromatogram of 15 antihistamine agents（peak numbers in tab 1）

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品储备液的制备 称取各对照品50 mg，用甲醇配制成质量浓度为1 mg·mL－1的单一对照品溶液。精密量取单一对照品液各0.5 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，精密量取1 mL，用甲醇稀释10倍，作为混合对照品储备液（S储，2.5 μg·mL－1）。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取供试样品0.2 g（颗粒剂或片剂需研细，硬胶囊去壳研细，口服液直接称取），置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇适量超声提取（功率200 W，频率25 kHz）20 min，冷却至室温，加甲醇定容至刻度，5000 r·min－1离心5 min，取上清液，经微孔滤膜（0.22µm，有机相）过滤，取续滤液待测。如果检测后判定为非法添加的阳性样品，其浓度超出线性范围，则在此基础上继续稀释。

2.4 标准曲线和线性范围

精密量取“2.3.1”项下混合对照品储备液适量，用甲醇稀释成2、5、10、20和50 ng·mL－1系列质量浓度的混合对照品溶液S1～S5（按质量浓度由低到高顺序编号），按“2.1”和“2.2”项下条件测定，以各化合物定量离子对峰面积值Y对质量浓度X（ng·mL－1）进行线性回归，各化合物的线性范围、回归方程和相关系数见表2。结果表明15种抗组胺化学药在各自质量浓度范围内与峰面积均呈良好线性关系，r均大于0.998。

2.5 检测限和定量限试验

精密量取“2.3.1”项下混合对照品储备液适量，用甲醇定量稀释，按“2.1”和“2.2”项下条件进行测定，以3倍信噪比计算检测限，以10倍信噪比计算定量限，结果见表2。

2.6 精密度试验

取“2.4”项下S3混合对照品溶液2 μL，按“2.1”和“2.2”项下条件测定，连续测定6次，计算，结果上述15种抗组胺类化学成分的峰面积RSD在0.90%～3.8%（见表2），表明方法的进样精密度良好。

表2 15种抗组胺类化学成分的线性参数、检测限、定量限和精密度Tab 2 Linearity parameters，quantitation limits，detection limits and precisions for 15 antihistamine agents

2.7 重复性试验

选择阳性检出率较高的胶囊制剂阴性样品作为回收试验基质，精密称取胶囊内容物0.2 g，共6份，分别置于50 mL量瓶中，精密加入“2.3.1”项下混合对照品储备液0.5 mL，照“2.3.2”项下方法制备，按“2.1”和“2.2”项下条件测定，15种抗组胺类化学成分峰面积RSD在0.40%～3.9%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收试验

精密称取“2.7”项下胶囊内容物0.2 g，置于50 mL量瓶中，精密加入“2.3.1”项下混合对照品储备液1 mL和S5混合对照品液 2 mL，作为高、低浓度回收率组。每个浓度水平配制6份，按“2.1”和“2.2”项下条件进行测定，结果15种抗组胺类化学成分的平均回收率均在82.9%～114.9%，峰面积RSD在0.080%～5.1%。

2.8 稳定性试验

取“2.4”项下S3混合对照品溶液，在室温放置0、4、8、12、16、20和24 h后，按“2.1”和“2.2”项下条件测定，结果15种抗组胺类化学成分的峰面积RSD在1.4%～3.3%（n＝6），表明15种抗组胺类化学成分溶液在24 h内稳定。

2.9 样品测定

53批标称止咳平喘、抗过敏、镇静安神、主治变应性鼻炎和皮肤病等类中成药及保健食品照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”和“2.2”项下条件测定，通过比较样品与对照品的保留时间以及定性离子对的相对丰度，判定样品中是否含有非法添加的药物。结果有8批样品呈非法添加阳性，阳性率为15.1%，阳性样品结果见表3。非法添加抗组胺类化学成分按频次依次为氯苯那敏、氯雷他定和异丙嗪，其中氯苯那敏和氯雷他定在内服制剂与外用软膏和洗剂中均有发现，异丙嗪在内服制剂中发现。8批阳性样品中有4批是标称止痒抗过敏，在不知情的情况下长期使用此类中成药及保健食品，容易导致药物依赖性皮炎，重则直接或间接导致死亡，值得监管部门的警惕与重视。

表3 阳性样品非法添加成分种类及含量Tab 3 Types and contents of detected components in positive samples

3 讨论

15种抗组胺类化学成分采用ESI＋正离子检测模式，为保证离子化效率，本方法分别比较了甲酸、甲酸-甲酸铵和乙酸-乙酸铵体系，发现甲酸-甲酸铵体系离子化效率最高，甲酸有助于化合物离子化，获得较优的色谱分离和质谱响应，甲酸铵能有效改善氯雷他定、氯苯那敏和氯丙嗪的峰形。两者形成的缓冲体系，通过离子强度和洗脱优化，最终确定0.1%甲酸-10 mmol·L－1甲酸铵为流动相体系，15种抗组胺类化学成分经梯度洗脱可在9.0 min内得到分离。本方法利用Agilent Masshunter Optimizer软件，优化母离子、碎裂电压、子离子和碰撞能量等质谱参数，特异性选择两级离子，确定合适的定性和定量离子，比对定性离子相对丰度比，排除干扰，确证阳性结果，同时保证定量离子响应，兼顾定性和定量要求。

本方法前处理简单，采用UPLC-MS/MS法在非常短的时间内实现了对15种抗组胺类化学成分快速分析，各化合物在MRM色谱图均得到有效分离，母离子和子离子碎片等质谱信息精度高，阳性结果定性准确，定量灵敏度高，可为监管部门打击非法添加行为和保障群众的食药安全提供技术保障。