不同产地酸枣果肉的品质评价研究

阮凯华，唐志书*，刘红波*，王梅，宋忠兴（1.陕西中医药大学/陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心，陕西 咸阳 71208；2.秦药特色资源研究与开发国家重点实验室（培育）/陕西中药产业研究院，陕西 咸阳 71208；.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000）

酸枣[Ziziphus jujubeMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou]来自于鼠李科（Rhammaceae）枣属（ZiziphusMill.）酸枣的干燥成熟果实，别名棘、棘子、野枣、山枣等。广泛分布于我国华北、西北广大低山丘陵地区，在中南地区各省市也有分布，资源蕴藏量巨大。目前，酸枣以其种仁“酸枣仁”作为药用部位被《中国药典》收载。然而，酸枣在生产过程中产生的大量酸枣果肉则常作为废弃物丢弃，目前尚未得到充分利用，不仅造成资源的极大浪费，亦增加了环境的承载压力。研究表明，酸枣果肉中含有丰富的黄酮类[1]、三萜及其皂苷类[2]、糖类[3]、生物碱类[4]、氨基酸类[5]等化学成分，具有镇静催眠[6]、抗氧化[7]、增强免疫力[8]、保肝[3]等多种功效。目前，酸枣果肉的利用研究多集中于食品方面，如酸枣醋[9]、酸枣面[10]、酸枣汁[11]等，针对酸枣果肉高值化综合利用的研究报道则较少，本研究系统地收集了多个产地的酸枣，从化学成分、抗氧化生物活性等方面综合分析比较了不同产地酸枣果肉的品质，以期为酸枣果肉的开发利用提供研究基础。

1 材料

1.1 仪器

LC-20XR高效液相色谱系统（日本岛津）；101型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；UV-2600 紫外可见分光光度计（SHIMADZU公司）；1510型全波长酶标仪（Thermo Fisher Scientfic OyRatastie 2 FI-01620 Vantaa Finiand）；DZKW-S-4型电热恒温水浴锅（上海科恒实业发展有限公司）；KS-300VDE型三频液晶超声波清洗器（昆山洁力美超声仪器有限公司）；十万分之一分析天平（Mettler Toledo）。

1.2 试药

实验用水为自制超纯水；醋酸铵（色谱级）、乙腈、甲醇（色谱纯）（Honeywell公司）；对照品白桦脂酸（批号：111802-201703，纯度≥98%）、齐墩果酸（批号：110709-201808，纯度≥91.8%）、熊果酸（批号：110742-201823，纯度≥99.9%）、没食子酸（批号：110831-201906，纯度≥91.5%）（中国食品药品检定研究院）；无水葡萄糖、维生素C（阿拉丁试剂公司）；ABTS[2，2'-叠氮基双（3-乙基苯并噻唑啉）-6-磺酸异二铵]、DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、福林酚（Sigma-Aldrich公司）；PBS（磷酸盐缓冲液）（BI）；其余试剂均为分析纯。

酸枣样品采自陕西延安、陕西吴堡县、陕西佳县、山西吕梁、山西长治、山西五台山、山东莱芜、山东沂蒙山、辽宁北票、辽宁朝阳县、辽宁孙家湾、北京太行山、河北翟沟、河北马厂沟、河北温暖河、新疆和田16个产地。经陕西中医药大学刘世军教授鉴定为鼠李科枣属植物酸枣[Ziziphus jujubeMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou]的果实。酸枣剥去核壳、种子，即得酸枣果肉。将酸枣果肉于50℃烘干后，置4℃冰箱中保存，备用。

2 方法与结果

2.1 总多糖、总酚含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加纯化水制成0.335 mg·mL－1的溶液，即得葡萄糖对照品溶液，4℃保存，备用。取没食子酸对照品适量，精密称定，加纯化水制成1 mg·mL－1的溶液，即得没食子酸对照品溶液，4℃保存，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取样品粉末（过三号筛）约0.3 g，精密称定，置10 mL离心管中，精密加入5 mL纯化水，称定重量，超声处理（功率250 W，频率20 kHz）30 min，取出，放冷，再称定重量，用纯化水补足减失的重量，摇匀。过滤，上清液置水浴锅上蒸干，加纯化水制成10 mg·mL－1的供试品溶液，4℃保存，备用。

2.1.3 总多糖含量测定方法 采用苯酚硫酸法测定总多糖含量，参考相关文献[12-14]对测定方法进行适当优化。精密量取葡萄糖对照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分 别 置10 mL具塞刻度试管中，各加纯化水定容至2.0 mL，摇匀，分别加入5%苯酚溶液1 mL，混匀后再加入浓硫酸5 mL，置于水浴中30 min，取出立即置冰水浴中冷却15 min，在490 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（Y），葡萄糖质量浓度为横坐标（X），得标准曲线回归方程Y＝52.22X＋0.0274。结果显示葡萄糖在4.19～25.13 μg·mL－1与吸光度线性关系良好（r＝0.9985）。

2.1.4 总酚含量测定方法 采用福林-酚法测定总酚含量（以没食子酸计），参考相关文献[15-16]对测定方法进行适当优化。精密吸取没食子酸对照品溶液适量，加纯化水分别稀释制成系列质量浓度的对照品溶液，各吸取对照品溶液200 μL置2 mL离心管中，加入100 μL福林酚试剂，摇匀，放置5 min；随后再缓慢加入500 μL 20% Na2CO3溶液，摇匀，避光30℃水浴30 min（每10 min摇匀1次），以纯化水为空白对照，在750 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（Y），没食子酸质量浓度为横坐标（X），得标准曲线回归方程Y＝46.116X＋0.0577。结果显示没食子酸在1.95～62.50 μg·mL－1与吸光度线性关系良好（r＝0.9995）。

2.1.5 不同产地酸枣果肉中总多糖和总酚含量测定 精密吸取不同产地酸枣果肉的供试品溶液0.2 mL，分别按“2.1.3”“2.1.4”项下方法测定，结果见表1。结果显示，不同产地酸枣果肉中总多糖含量存在较大差异，其中山西五台山（S7）中总多糖含量最高，达（67.93±0.58）mg·g－1；而山东莱芜（S8）果肉中总多糖含量最低，为（35.19±0.31）mg·g－1。不同产地酸枣果肉中总酚含量同样存在较大差异，结果表明，河北马厂沟（S15）酸枣果肉中总酚含量最高，达（5.89±0.03）mg·g－1；而河北温暖河（S16）酸枣果肉中总酚含量较低，为（3.43±0.00）mg·g－1。

2.2 总三萜酸含量测定

2.2.1 溶液的制备 取熊果酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇超声溶解，制成0.1048 mg·mL－1的溶液，即得熊果酸对照品溶液，4℃保存，备用。供试品溶液的制备同“2.1.2”项下。

2.2.2 测定方法 采用香草醛-高氯酸比色法测定总三萜酸含量，参考相关文献[17-19]对测定方法进行适当优化。精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL熊果酸对照品溶液置于具塞试管中，85℃水浴挥发溶剂，依次加入0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，摇匀后置于60℃水浴加热15 min，取出后迅速用流水冷却至室温，加入5.0 mL冰醋酸摇匀，在540 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（Y），熊果酸质量浓度为横坐标（X），得标准曲线回归方程Y＝36.922X＋0.0651。结果显示熊果酸在3.49～17.47 μg·mL－1与吸光度线性关系良好（r＝0.9996）。

2.2.3 不同产地酸枣果肉中总三萜酸含量测定精密吸取供试品溶液0.2 mL置于10 mL具塞试管中，按“2.2.2”项下方法测定，结果见表1。结果显示，不同产地酸枣果肉中总三萜酸含量存在较大差异，结果表明，辽宁北票（S10）酸枣果肉中总三萜酸含量最高，为（3.96±0.01）mg·g－1；而陕西延安（S1）酸枣果肉中总三萜酸含量较低，为（1.93±0.00）mg·g－1。

表1 不同产地酸枣果肉信息及各成分含量测定结果(±s，n＝3，mg·g－1)Tab 1 Sample information of sour jujube from different origins and content of major components (±s，n＝3，mg·g－1)

表1 不同产地酸枣果肉信息及各成分含量测定结果(±s，n＝3，mg·g－1)Tab 1 Sample information of sour jujube from different origins and content of major components (±s，n＝3，mg·g－1)

样品编号 产地 总多糖 总酚 总三萜酸 三萜酸类白桦脂酸 齐墩果酸 熊果酸 三萜酸类总和S1 陕西延安 38.02±0.08 5.22±0.05 1.93±0.00 0.51±0.06 0.45±0.08 0.48±0.13 1.44±0.27 S2 陕西吴堡县 55.85±0.31 4.21±0.06 3.11±0.01 0.27±0.03 0.16±0.00 0.29±0.02 0.71±0.01 S3 陕西佳县（大果） 46.83±0.09 3.82±0.08 2.58±0.00 0.47±0.01 0.40±0.01 0.46±0.03 1.33±0.03 S4 陕西佳县（小果） 38.59±0.04 5.24±0.04 2.95±0.01 0.67±0.02 0.40±0.00 0.42±0.02 1.49±0.01 S5 山西吕梁 45.21±0.28 4.07±0.04 2.47±0.03 0.30±0.03 0.19±0.03 0.35±0.03 0.84±0.09 S6 山西长治 67.20±0.35 4.05±0.03 3.43±0.01 0.31±0.03 0.18±0.04 0.33±0.02 0.83±0.09 S7 山西五台山 67.93±0.58 4.14±0.03 2.60±0.01 0.27±0.03 0.21±0.01 0.20±0.02 0.68±0.06 S8 山东莱芜 35.19±0.31 5.18±0.02 2.53±0.01 0.51±0.03 0.32±0.03 0.35±0.05 1.18±0.11 S9 山东沂蒙山 54.83±0.51 4.42±0.06 3.43±0.01 0.55±0.03 0.28±0.07 0.28±0.05 1.12±0.08 S10 辽宁北票 46.69±0.15 4.15±0.10 3.96±0.01 0.36±0.01 0.30±0.02 0.29±0.01 1.06±0.04 S11 辽宁朝阳县 40.32±0.20 4.84±0.02 3.94±0.01 0.59±0.06 0.31±0.07 0.31±0.05 1.21±0.18 S12 辽宁孙家湾 52.56±0.28 4.18±0.04 3.13±0.01 1.33±0.01 0.54±0.00 0.47±0.01 2.33±0.01 S13 北京太行山 37.91±0.16 5.26±0.02 3.13±0.02 0.47±0.02 0.34±0.03 0.33±0.05 1.14±0.09 S14 河北翟沟 66.60±0.54 3.83±0.03 2.11±0.01 0.27±0.01 0.25±0.01 0.24±0.02 0.75±0.05 S15 河北马厂沟 48.62±0.11 5.89±0.03 2.38±0.01 1.15±0.16 0.92±0.12 0.54±0.11 2.61±0.39 S16 河北温暖河 58.39±0.34 3.43±0.00 2.83±0.01 0.43±0.06 0.27±0.00 0.24±0.03 0.93±0.03 S17 新疆和田 66.36±0.32 4.05±0.02 2.85±0.02 0.28±0.03 0.20±0.02 0.18±0.03 0.67±0.08平均值 51.01±11.34 4.47±0.67 2.90±0.57 0.52±0.04 0.34±0.03 0.34±0.03 1.20±0.55

2.3 白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸的含量测定、指纹图谱及相似度评价

2.3.1 对照品储备液的制备 取白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成质量浓度分别为白桦脂酸（0.535 mg·mL－1）、齐墩果酸（0.545 mg·mL－1）、熊果酸（0.54 mg·mL－1）的对照品储备液，经0.22 μm的微孔滤膜滤过，4℃保存，备用。

2.3.2 供试品溶液的制备 取样品粉末约0.5 g，精密称定，置15 mL离心管中，精密加入10 mL甲醇，称定重量，超声处理（功率250 W，频率20 kHz）30 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀。过滤，取上清液，经0.22 μm的微孔滤膜滤过，4℃保存，备用。

2.3.3 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液＝67∶12∶21（V∶V∶V），流速：1.0 mL·min－1；柱温：30℃；进样量：10 μL；检测波长：210 nm。

2.3.4 方法学考察 取“2.3.1”项下各对照品储备液，加甲醇分别稀释制成系列质量浓度的对照品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进行分析，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度（mg·mL－1）为横坐标（X），进行线性回归分析。结果白桦脂酸回归方程为Y＝2×106X＋8205.3，线性范围为0.004～0.535 mg·mL－1（r＝0.9999）；齐墩果酸回归方程为Y＝4×106X＋15 993，线性范围为0.004～0.545 mg·mL－1（r＝0.9996）；熊果酸回归方程为Y＝4×106X＋11 487，线性范围为0.004～0.540 mg·mL－1（r＝0.9997）。

精密度试验结果显示，对照品溶液中各待测成分峰面积的RSD均小于2.7%（n＝6）；重复性试验结果显示，供试品溶液中各待测成分峰面积的RSD均小于2.6%（n＝6）；稳定性试验结果显示，各待测成分峰面积的RSD均小于3.0%（n＝6）；回收试验结果显示，各待测成分的平均加样回收率为98.12%～101.17%，RSD均小于3.1%（n＝6）。表明方法学满足《中国药典》要求。

2.3.5 含量测定、指纹图谱及相似度评价 将不同产地酸枣果肉按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件测定白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸的含量，结果见表1。齐墩果酸和熊果酸含量差异不大，相比于齐墩果酸和熊果酸，白桦脂酸含量相对较多。河北马厂沟（S15）的酸枣果肉中3种三萜酸类成分含量最高，辽宁孙家湾（S12）三萜酸类次之；新疆和田（S17）和山西五台山（S7）成分含量较低。将不同产地的供试品色谱图分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”（版本：2012.130723），时间窗设为0.1，采用中位数法生成对照指纹图谱（见图1），其中共有峰12个，通过对照品比对指认白桦脂酸（7号峰）、齐墩果酸（8号峰）和熊果酸（9号峰）。计算S1～S17指纹图谱与对照指纹图谱相似度均在0.90以上，符合指纹图谱相似度要求，表明不同产地酸枣果肉有较好的一致性（见表2）。

图1 不同产地酸枣果肉样品HPLC图Fig 1 HPLC of sour jujube pulp samples from different origins

表2 不同产地样品指纹图谱与对照指纹图谱相似度Tab 2 Similarity between sample fingerprints of different origins and control fingerprints

2.3.6 不同产地酸枣果肉三大类成分含量的聚类分析 将不同产地酸枣果肉中三大类成分的含量测定结果采用聚类分析法结合欧氏距离（d）进行分析，生成不同产地酸枣果肉中成分含量的聚类分析树状图（见图2）。以d＝10划分，不同产地样品共聚成四类：样品S7、S6、S17、S14聚为第Ⅰ类，样品S16、S12、S9、S2聚为第Ⅱ类，样品S15、S5、S10、S3聚为第Ⅲ类，样品S8、S11、S1、S13、S4聚为第Ⅳ类，每个聚类中各产地之间三大类成分（总多糖、总酚、总三萜酸）含量比较接近。其中，第Ⅰ类中各产地三类成分含量总和最大，均大于72.54 mg·g－1，此类产地总多糖含量较多，总三萜酸和总酚含量居于中上。第Ⅱ类中各产地三类成分含量总和次之，均大于59.85 mg·g－1，此类产地中三大类成分含量都居于中上，总三萜酸含量相比于其他类别较多。第Ⅲ类中各产地三类成分含量总和居于中等，均大于51.75 mg·g－1，此类产地中三大类成分含量都居于中等。第Ⅳ类中各产地三类成分含量总和最低，均低于49.10 mg·g－1，此类产地中总酚含量相比其他类别含量最高，总多糖含量相比其他类别最低。由此可知，各产地酸枣果肉中成分含量有差异，总三萜酸含量差异不大，总多糖和总酚含量差异较大。

图2 不同产地酸枣果肉三大类成分含量的聚类分析树状图Fig 2 Cluster analysis tree diagram of the content of the three major components in sour jujube pulp from different origins

2.4 抗氧化活性的测定

2.4.1 供试品溶液的制备 将“2.1.2”项下制备的供试品溶液稀释10倍，得到质量浓度为1 mg·mL－1的待测溶液。储存4℃，备用。

2.4.2 DPPH法 称取DPPH试剂和维生素C适量，分别加无水乙醇制得0.1 mmol·L－1的DPPH溶液和1 mg·mL－1的维生素C溶液。参照文献方法[20-21]，设对照组、样品组、阳性对照组和空白组。对照组为100 μL无水乙醇＋100 μL DPPH试剂；样品组为100 μL样品＋100 μL DPPH试剂；阳性对照组为100 μL 维生素C溶液＋100 μL DPPH试剂；空白组为200 μL 无水乙醇。将上述混合溶液加到96孔板中，各组均重复3次，轻轻混匀。避光反应 30 min，于酶标仪517 nm处测定其吸光度（A）值。按公式（1）计算清除率。A0为对照组吸光度值，A为样品组吸光度值。

2.4.3 ABTS法 精密称取ABTS试剂和过硫化钾适量，用蒸馏水溶解，制得7.4 mmol·L－1的ABTS溶液和2.6 mmol·L－1的过硫化钾溶液。将上述两种溶液1∶1混合，室温避光放置12 h，用PBS稀释至在734 nm 波长吸光度为（0.7±0.02），即得ABTS工作液。参照文献方法[22-23]，设对照组、样品组、阳性对照组和空白组。将200 μL工作液与各组试样50 μL混合加至96孔板上，混合静置6 min，各组均重复3次，于酶标仪734 nm处测定其吸光度（A）值。按公式（1）计算清除率。

DPPH·清除率结果显示（见表3），陕西延安（S1）酸枣果肉DPPH·清除率最高，陕西佳县（大果）（S3）酸枣果肉DPPH·清除率最低。ABTS·＋清除率结果显示（见表3），河北马厂沟（S15）酸枣果肉ABTS·＋清除率最高，河北温暖河（S16）酸枣果肉ABTS·＋清除率最低。采用SPSS 26.0对16个产地酸枣果肉的总多糖、总三萜酸、总酚与其对应的DPPH、ABTS法测定的抗氧化活性进行斯皮尔曼相关性分析。不同产地的酸枣果肉的总多糖、总三萜酸、总酚含量与其抗氧化活性具有相关性，其中，总酚的含量与ABTS抗氧化活性存在较大的相关性，相关系数为0.771（P＜0.01）。其他成分和抗氧化活性低度相关。结合总酚含量测定结果和抗氧化活性结果分析，河北马厂沟（S15）样品具有较高的抗氧化活性。

表3 不同产地酸枣果肉抗氧化活性结果(±s，n＝3)Tab 3 Antioxidant activity results of sour jujube pulp from different producing areas (±s，n＝3)

表3 不同产地酸枣果肉抗氧化活性结果(±s，n＝3)Tab 3 Antioxidant activity results of sour jujube pulp from different producing areas (±s，n＝3)

样品编号 产地 DPPH·清除率/%ABTS·＋清除率/%S1 陕西延安 56.23±2.49 74.29±0.34 S2 陕西吴堡县 54.33±2.49 62.06±0.90 S3 陕西佳县（大果） 39.54±1.01 70.58±0.76 S4 陕西佳县（小果） 44.68±0.62 76.63±0.52 S5 山西吕梁 54.16±2.92 64.97±0.62 S6 山西长治 54.71±3.02 65.03±0.75 S7 山西五台山 47.16±1.85 60.75±0.30 S8 山东莱芜 54.84±2.55 78.11±0.12 S9 山东沂蒙山 51.90±2.96 69.26±0.49 S10 辽宁北票 47.71±2.71 56.97±0.45 S11 辽宁朝阳县 49.08±1.88 74.81±0.61 S12 辽宁孙家湾 47.48±2.78 65.06±0.23 S13 北京太行山 52.47±3.05 81.38±0.15 S14 河北翟沟 48.80±1.75 64.10±0.23 S15 河北马厂沟 54.50±3.42 87.17±0.36 S16 河北温暖河 48.75±1.97 55.21±0.18 S17 新疆和田 49.29±3.42 59.23±0.15

3 讨论

本文对酸枣果肉的化学成分进行测定并进行抗氧化活性评价，发现酸枣果肉中总多糖、总三萜酸、总酚等资源型化学成分含量丰富且抗氧化活性显著。不同产地之间各成分含量和抗氧化活性有显著差异，可能是由其生长环境、气候、地域性等综合因素导致。总三萜酸成分含量测定结果与白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸单一成分含量不一致，这可能是由酸枣果肉中多种三萜酸成分综合作用的结果，因此，酸枣果肉中某单一三萜酸的含量并不能作为其总三萜酸含量高低的评价指标，反之亦然。三大类成分聚类分析，将产地分为4个类别，各类别产地之间成分有一定差异，第Ⅰ类产地样品中总多糖含量高，第Ⅳ类产地样品中总酚含量较高。第Ⅱ类和第Ⅲ类产地样品中各成分含量都居中。抗氧化活性结果显示总酚与抗氧化活性相关性较高，河北马厂沟（S15）样品具有较高的总酚含量，同时抗氧化活性也较高。

酸枣生长于海拔1700 m 以下的山区、丘陵或平原，分布于中国华北、西北等地。本种原产于我国，现在亚洲、欧洲和美洲常有栽培。以河北南部的邢台为中心的太行山区是我国野生酸枣资源面积最大、保护最好、产量最高、品质最优的地区。河北素有“邢台酸枣甲天下”之美誉，是中国最大的酸枣产业基地。综合本研究中各成分及活性结果，河北邢台马厂沟的酸枣果肉资源利用度高，这也与河北一直是酸枣主产区相对应。

中药资源类群中资源型化学成分的多途径、多层次、精细化利用是中药资源高效利用和可持续发展的重要策略[24]。综上所述，酸枣果肉中资源型化学成分丰富多样，本文对不同产地酸枣果肉进行了综合评价，为各类型资源型化学成分的潜在利用价值的产业化开发提供了参考依据，提高了酸枣的综合利用效率。