西洋参总皂苷对急性血瘀模型大鼠的作用研究

司雨，李乐，陈小玲，司函瑞，史大臻，刘金平，李平亚，焦玉凤（吉林大学药学院天然药物研究中心，长春 130021）

心血管疾病是目前全球发病率和死亡率最高的疾病之一[1]。多种心脑血管疾病共同发展，会导致一种病理生理过程，即血瘀证，这是中医临床上常见的一种证候。瘀血是由于血液运行不畅凝聚于某一局部而形成的病理产物，导致许多新的病症，血瘀证是瘀血引起的最典型的病证[2]。目前，研究最多的血瘀证模型有气虚血瘀证[3-4]、气滞血瘀证[5-6]、寒凝血瘀证[7-8]等。寒凝血瘀证又被称为急性血瘀模型[9-10]，目前使用最广泛的是采用冰水浴加皮下注射肾上腺素，其成功率较高，造模方法稳定，与临床病症结合度高，很好地验证了中医对于血瘀证“寒则凝，凝则成瘀”的理解[11]。有研究表明，血瘀证涉及多个复杂的病理生理变化，主要表现为血液流变学的变化[12-15]、凝血功能的异常[16]。血液流变学是流动性质与变形规律的科学，具有重要的临床价值，已广泛应用于许多疾病的诊断。凝血四项是评估溶栓治疗的监测、临床出血性或血栓性疾病、抗凝血药物用量监控以及外科手术前凝血功能的重要指标。

西洋参（Panax quinquefoliumL.）系五加科（Araliaceae）人参属，又称花旗参，主产于加拿大魁北克、美国威斯康辛、中国吉林和山东等地[17]。西洋参性寒，以养阴生津作用为主[18]。西洋参主要含有皂苷类、糖类、挥发油类等活性成分，其中人参皂苷是其发挥药理作用的主要活性物质。众多研究表明西洋参总皂苷（PQS）具有丰富的药理活性，主要体现在提高机体免疫力[19]、抗心肌缺血[20]、抗肿瘤[21]、降血糖[22]、降血脂[23]、改善认知[24]等方面。研究发现，西洋参及其活性成分对心血管疾病具有一定疗效[25-27]。王宝君等[28]研究表明，西洋参茎叶总皂苷联合氯吡格雷和阿司匹林干预急性心肌梗死（AMI）大鼠，对血管内皮功能有协同保护作用，并可改善大鼠AMI后心室重构，有进一步抑制血小板聚集和血栓形成的趋势。于远航等[29]研究发现，参七汤（西洋参、三七）可干预促进皮冠状动脉介入治疗（PCI）术后患者的血清白细胞介素10（IL-10）、转化生长因子β1（TGF-β1）的合成，从而促进血管内皮修复，进而有利于心脏康复。但鲜有研究报道PQS的抗血瘀活性。本实验首次探讨了PQS对急性血瘀模型大鼠血液流变学及血浆中α颗粒膜蛋白（GMP-140）、血管性血友病因子（vWF）的影响，为西洋参用于心血管疾病的治疗提供了实验依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级健康Wistar雄性大鼠60只，体质量180～220 g [长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，质量合格证号：SCXK（吉）-2020-0008]。

1.2 试药

新鲜西洋参根于2018年10月采集于吉林省敦化市，经吉林大学药学院天然药物研究中心李平亚教授鉴定为五加科植物西洋参Panax quinquefoliumL.的根。取西洋参药材，用粉碎机粗打，取粗料10 kg，在小型多功能提取罐中，以80%乙醇加热提取3次，每次1.5 h，合并提取液，回收乙醇至无醇味，加水稀释至10 L，过滤，滤液上D101大孔吸附树脂，用蒸馏水洗脱至无色，继续用95% 乙醇洗脱至Molish反应为阴性，减压浓缩，除去乙醇，蒸馏水稀释后微孔滤膜过滤，冷冻干燥，得PQS（纯度为75.28%），备用。

脑心通胶囊（规格：0.4 g/粒，陕西步长制药有限公司，批号：171269）；盐酸肾上腺素注射液（规格：10 mL/支，遂成药业股份有限公司，批号：51767172）；水合氯醛（分析纯，北京化工厂，批号：B0601012）；大鼠血浆GMP-140 ELISA检测试剂盒、大鼠vWF ELISA 检测试剂盒（长春鼎国生物技术有限责任公司的R＆D Systems分装试剂盒）；Sysmex-凝血试剂（日本希森美康株式会社）。

1.3 仪器

FA1104N型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；TGL-16aR型超高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；TECAN SUNRISE 酶标仪（瑞士帝肯公司）；KES-900B型血流变检测仪（无锡康尔生仪器公司）；CA-50血凝仪（日本希森美康株式会社）。

2 方法

2.1 动物分组及给药

取PQS粉末，用蒸馏水配成质量浓度为高（40 mg·mL－1）、中（20 mg·mL－1）、低（10 mg·mL－1）3个剂量的供试药液。

Wistar大鼠适应性饲养一周，饲养条件为室温（22±2）℃，湿度40%～60%。该实验获吉林大学动物管理委员会（IACUC）的批准。将大鼠按体质量随机分为6组，每组10只，包括正常对照组，模型组，PQS高（400 mg·kg－1）、中（200 mg·kg－1）、低（100 mg·kg－1）剂量组和阳性对照组（脑通灵200 mg·kg－1）。每日上午9点灌胃给药，每日1次，连续8 d。

2.2 急性血瘀模型大鼠的制备

除正常组大鼠外，其他组大鼠每次灌胃给药30 min后，置于冰水混合物中（0～1℃）游泳6 min，连续7 d，并于第8日后，皮下注射0.1%肾上腺素0.8 mL·kg－1，共两次，中间间隔2 h，用以制备急性血瘀模型[30-32]。

2.3 血液流变学指标的测定

大鼠末次注射肾上腺素后，禁食不禁水过夜，第9日末次灌胃给药40 min后，腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg－1麻醉大鼠[32]，腹主动脉取血。取1 mL全血置于血流变检测仪，测定全血低切（20·s－1）、中切（60·s－1）及高切（150·s－1）黏度，剩余全血3000 r·min－1，离心10 min，取上层血浆1 mL进行血浆黏度测定（140·s－1）。检测应在采血后3 h内全部完成。测定过程中，使用肝素化试管抗凝。

2.4 血浆抗凝实验

取抗凝管中血液2 mL，于25℃下3000 r·min－1离心 10 min。采用CA-50血凝仪及配套试剂，严格按照说明进行操作，测定上层血浆凝血四项，即凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血酶原时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原含量（FIB）。

2.5 血浆GMP-140蛋白及vWF含量的测定

将抗凝管中的血液在3000 r·min－1离心20 min，吸取上层血浆分别按照ELISA检测试剂盒说明书进行操作，测定大鼠血浆GMP-140及vWF的含量。

2.6 统计方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理，实验结果以均数±标准差（±s）表示，组间统计分析采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 PQS对急性血瘀模型大鼠血液流变学的影响

由表1可知，与正常对照组比较，模型组的全血低、中、高切黏度、血浆黏度及红细胞聚集数明显增加（P＜0.01），即为模型成功大鼠。与模型组比较，PQS低、中、高剂量组大鼠全血低、中、高切黏度、血浆黏度和红细胞聚集数显著降低（P＜0.05，P＜0.01），表明PQS有明显改善急性血瘀模型大鼠的血液流变学作用；阳性对照组可使急性血瘀模型大鼠血液流变学指标显著降低（P＜0.01）。

表1 PQS对血瘀模型大鼠全血黏度及血浆黏度的影响(±s，n＝10)Tab 1 Effect of PQS on whole blood viscosity and plasma viscosity in rats with blood stasis (±s，n＝10)

表1 PQS对血瘀模型大鼠全血黏度及血浆黏度的影响(±s，n＝10)Tab 1 Effect of PQS on whole blood viscosity and plasma viscosity in rats with blood stasis (±s，n＝10)

注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the normal control group，##P＜0.01；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01.

组别 给药剂量/（mg·kg－1）全血黏度/（mPa·s） 血浆黏度/（mPa·s－1） 红细胞聚集数20·s－1 60·s－1 150·s－1正常对照组 － 8.31±0.28 6.26±0.16 4.48±0.32 1.12±0.23 1.31±0.14模型组 － 12.31±0.26## 8.24±0.21## 6.60±0.28## 1.81±0.31## 1.53±0.28##PQS给药组 100 10.31±0.59* 6.78±0.59* 4.78±0.42* 1.69±0.10* 1.49±0.21 200 9.52±0.54** 6.36±0.42** 4.61±0.16** 1.59±0.08** 1.42±0.29**400 9.86±0.64** 6.48±0.26** 4.68±0.26** 1.62±0.21** 1.45±0.33*阳性对照组 200 9.42±0.41** 6.28±0.36** 4.56±0.2** 1.54±0.21** 1.39±0.31**

3.2 PQS对急性血瘀模型大鼠凝血功能的影响

由表2可知，与正常对照组比较，模型组PT、APTT和TT显著减少，FIB显著增高（P＜0.01），表明模型组凝血功能被明显激活，即为造模成功。与模型组比较，PQS低、中、高剂量组，均明显延长PT、APTT 和 TT，明显降低FIB（P＜0.05，P＜0.01）。且高剂量组的效果与阳性对照组接近，表明PQS可显著改善急性血瘀大鼠凝血指标，具有明显的活血化瘀作用。

表2 PQS对血瘀模型大鼠凝血四项指标的影响(±s，n＝10)Tab 2 Effect of PQS on the coagulation factors in rats with blood stasis (±s，n＝10)

表2 PQS对血瘀模型大鼠凝血四项指标的影响(±s，n＝10)Tab 2 Effect of PQS on the coagulation factors in rats with blood stasis (±s，n＝10)

注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the normal control group，##P＜0.01；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01.

凝血功能指标APTT/s TT/s PT/s FIB/（g·L－1）正常对照组 － 23.41±2.88 21.14±1.21 29.24±4.67 1.68±0.32模型组 － 16.33±2.13## 14.19±1.01## 21.87±3.69## 5.01±0.66##PQS给药组 100 18.24±3.12 17.15±0.29 23.62±3.98 4.32±0.62 200 19.43±4.02* 18.08±0.88* 24.92±4.01* 3.82±0.51*400 20.65±2.62** 18.98±0.62** 26.52±5.66** 3.04±0.03**阳性对照组 200 21.68±0.44** 19.32±0.89** 27.66±2.82** 2.69±0.23**组别 剂量/（mg·kg－1）

3.3 PQS对血浆GMP-140及vWF含量的影响

由表3可知，与正常对照组比较，模型组大鼠血浆GMP-140及vWF含量显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，PQS低、中、高剂量组可使模型大鼠血浆GMP-140及vWF含量明显降低（P＜0.05，P＜0.001），其中中剂量组最为显著；阳性对照组可使模型大鼠血浆GMP-140及vWF水平明显降低（P＜0.01）。

表3 PQS对血瘀模型大鼠血浆GMP-140及vWF含量的影响(±s，n＝10)Tab 3 Effect of PQS on the content of GMP-140 and vWF in rats with blood stasis (±s，n＝10)

表3 PQS对血瘀模型大鼠血浆GMP-140及vWF含量的影响(±s，n＝10)Tab 3 Effect of PQS on the content of GMP-140 and vWF in rats with blood stasis (±s，n＝10)

注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the normal control group，##P＜0.01；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01.

vWF/（pg·mL－1）正常对照组 － 6.5±0.1 626±62模型组 － 10.5±0.4## 1066±159##PQS给药组 100 8.8±0.9* 971±52*200 7.7±0.8** 789±148**400 8.3±0.1** 811±65**阳性对照组 200 7.4±0.8** 766±65**组别 给药剂量/（mg·kg－1）GMP-140/（ng·mL－1）

4 讨论

近年来，由于人们饮食作息不规律以及工作强度较大，导致血瘀体质的群体增多，因此对于血瘀证和促进血液循环，活血祛瘀等研究日渐深入。血瘀证涉及血管堵塞，从而影响血管循环，与多重疾病的发生都有关联，比如心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病等[33]。

皂苷是一类结构相对复杂的化合物，主要包括三萜皂苷和甾体皂苷，生物活性较高。大量研究表明，皂苷类组分对血瘀证的作用显著，主要从血液流变学、血瘀高凝状态的改善等方面起到活血化瘀作用[34-35]。PQS是从西洋参根部提取的皂苷类成分，王蕾等[36]认为，PQS具有缓解冠心病患者心肌缺血症状、改善心功能缺血的功能。鞠传静等[37]认为，西洋参叶二醇组皂苷可能通过改善心室重构大鼠的左心收缩和舒张功能发挥防治心室重构的作用。在中医理论中，过劳过寒有伤形体。本研究在复制急性血瘀大鼠模型时，将大鼠置于冰水混合物中（0～1℃）6 min，逐渐使其过劳过寒。研究中采用的急性血瘀模型的方法与传统血瘀模型制备方法相比，具有死亡率低，造模成功率高等有优点。气行则血行，气虚则血滞。急性血瘀大鼠模型的血液流变学及血小板聚集等指标发生改变[38]，具有“浓、黏、凝、聚”的特点。

血液流变学作为主要研究循环血液的流动性、变形性、凝固性及其成分流动、变形规律的科学[39]，其指标出现异常，会引起机体血液循环障碍，从而导致血栓的形成，而全血黏度和血浆黏度则是反应血液流变性质的重要指标。高剪切率（150·s－1）下的血液黏度可反映红细胞的变形能力；中剪切率（60·s－1）下的血液黏度反映红细胞解聚后无变形时的水平变化；低切变率（20·s－1）下的血液黏度则反映红细胞聚集能力[40-41]。本研究血液流变学指标显示，PQS 100、200、400 mg·kg－1三个浓度均能显著降低急性血瘀模型大鼠全血黏度、血浆黏度、全血还原黏度及红细胞聚集指数，增强红细胞变形能力，改善血液流变性，使得血液便于流动，可初步证明其能改善急性血瘀状态。

凝血四项（PT、TT、APTT、FIB）是判断机体止血与凝血系统病理变化的重要指标，也是临床上诊断血瘀最必要的检查项目。PT用于检测外源性凝血系统，其延长可客观反映多种凝血因子的含量降低[42]；TT用于检测内、外源性凝血途径的共同凝血途径[43]；APTT用于检测内源性凝血途径，APTT的缩短可客观反映含有促凝物质或凝血因子活性增高[44]；FIB可表示纤维蛋白原的数量，其分子容易弯曲，引起分子间牵连，其量越多，高切率下的全血黏度越高[45]。当机体PT、TT、APTT等缩短，FIB延长，可激发内源性、外源性凝血系统活性，导致凝血功能紊乱，引起血小板聚集，血浆黏度增高，从而形成血栓。本研究凝血功能指标显示，与模型组相比，PQS 200、400 mg·kg－1给药后PT、TT、APT显著延长，FIB显著缩短。中、高剂量PQS可通过作用于外源性凝血系统、内源性凝血系统以及血小板系统，减少血凝过程和血小板聚集，改善血瘀症状。

GMP-140又称P-选择素，是活化血小板的敏感分子标志物，常存在于血小板、内皮细胞的Weibel-palade小体及颗粒膜上[46]。当体内发生血栓时，血小板或内皮细胞活化，GMP-140可迅速在血小板质膜上表达，介导单核细胞、中性粒细胞与活化血小板的结合[47]。vWF是血栓形成和止血过程中常见的糖蛋白，也是一种众所周知的反应血管内皮损伤的指标[48]。vWF参与调节血小板黏附到血管壁过程，当血管内膜粥样斑块破裂，内皮细胞下基质中的胶原暴露，与大量的vWF结合，形成血栓。本研究结果表明PQS有明显降低血瘀模型大鼠血浆GMP-140及vWF含量的作用，从而减少血小板活化，导致了血液流变学的改变。

综上所述，本实验从血液流变学、凝血功能和血小板相关蛋白方面探讨PQS改善急性血瘀症状，从降低血液黏度、抑制血小板活化和黏附聚集、抑制血栓形成等方面进行验证，为PQS抗血瘀的药理作用提供了有力的科学依据，但其抗血瘀的具体机制尚有待进一步研究。