沉默环状RNA hsa_circ_0076535表达对食管鳞癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

杨潇，胡龙淼

（1.上海市嘉定区安亭医院 内科，上海 201800；2.国家肝癌科学中心 上海 201800）

食管癌（EC）是一种常见的癌症类型，其致死率位于全球癌症死亡的第6 位［1］。食管鳞状细胞癌（ESCC）是一种由食管上皮细胞诱导的肿瘤，是EC 最常见的疾病亚型［2］。ESCC 具有极高的致死率，Ⅲ期ESCC 患者5 年内总生存率仅为10%～15%，Ⅳ期患者的中位生存期<1 年。ESCC 诊断和预后主要面临该症状的晚期出现、内窥镜检查的成本或不适用、不敏感性及生物标志物的非特异性［1，3］。因此，迫切需要寻找用于ESCC 诊断、治疗及预后、新的敏感且成本有效的生物标志物。

环状RNA（circRNAs）正在成为非编码RNA界的新星，是近些年研究癌症诊断、治疗及预后潜在分子靶点的热门方向［4］。circRNAs 通过连接游离的3'-至5'-末端形成环状结构，与mRNA 或线性非编码RNA 相比，其具有更高的稳定性，且不含RNA 核酸外切酶［5］。circRNAs 不仅存在于细胞内，还可以输出到细胞外发挥作用［6］。CricRNAs的这一特性使其可以通过进入到血液中作为检测样本的生物标志物，更重要的是circRNAs 被证实能够在特定细胞类型或特定病理条件下表达［7］。此外越来越多的证据表明，circRNAs 被确认为癌症的诊断或预后生物标志物，例如胶质瘤［8］和喉鳞状细胞癌［9］等。然而关于circRNAs 在ESCC 中作为生物标志物的相关信息仍然需要继续探索。有研究表明，circRNA hsa_circ_0076535 在ESCC肿瘤组织内表达升高，但是其对ESCC 细胞的影响仍旧未知［10］。本研究通过下调细胞内hsa_circ_0076535 的表达水平观察其对ESCC 细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，为寻找新型ESCC 肿瘤生物标志物及治疗靶标奠定基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料

所有原发性ESCC 肿瘤组织及与之相匹配的正常组织均来自于2016 年1 月至2018 年12 月在上海市嘉定区安亭医院接受手术的ESCC 患者，并通过经验丰富的病理学家确认。所有患者术前均经食管镜活检病理学证实为ESCC，且术前未进行放化疗。所有患者签署书面知情同意书，且该研究得到了医院癌症伦理委员会的批准，所有程序都是按照相关指南进行。

1.2 方法

1.2.1 细胞株及主要试剂 人ESCC 细胞株Het-1A、Eca109、KYSE170 均来自于美国标准生物品收藏中心（ATCC）。RPMI 1640 细胞培养基购买于南京KeyGen 公司，胰蛋白酶及RIPA 细胞裂解液、RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、Platinum SYBR Super Mix 试剂及Lipofectamine 2000均购买于美国Invitrogen 公司，PCR 引物购自南京金斯瑞生物科技有限公司。hsa_circ_0076535 干扰siRNA 片段由广州锐博生物科技公司设计并合成。Matrigel 基质胶购自美国BD 公司，CCK-8 试剂盒购买于北京普洛麦格生物科技有限公司，Transwell小室（孔径3.0 μm）购买于美国Corning 公司，免疫组织化学试剂盒及DAB 试剂盒均购自于美国R&D Systems。

1.2.2 RNA 提取及实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）根据RNA 提取试剂盒说明书从组织及细胞样本中提取总RNA 分子，然后按照反转录试剂盒说明书操作将RNA 反转录为cDNA，随后进行PCR 反应对cDNA 进行扩增，以GAPDH作为内参。hsa_circ_0076535 及GAPDH PCR 引物序列如下，hsa_circ_0076535 正向引物：5'-GCGCCACTATGCCCAGCTAA-3'，反向引物：5'-GGCTGAGACGGGCAGATCAC-3'。GAPDH 正向引物：5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'，反向引物：5'-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3'。所有实验均重复3 次。

1.2.3 细胞培养及转染 将所有细胞在RPMI 1640培养基、37℃、5%二氧化碳CO2恒温培养箱中进行细胞培养。通过Lipofectamine 2000 转染试剂将hsa_circ_0076535 的siRNA 干扰片（si-circ）或对照基因片段（si-NC）转染进KYSE170 细胞内，所有操作均按照转染试剂说明书进行，转染24 h 后进行下一步操作。

1.2.4 CCK-8 检测细胞增殖能力 通过CCK-8 实验检测KYSE170 细胞增殖能力，所有步骤均按照试剂盒说明书进行。按照3000 细胞/孔将KYSE170 细胞种植于96 孔板内，分别在转染后的0 h、24 h、48 h、72 h 及96 h 对细胞增殖能力进行检测。在每个96 孔板的孔中均加入10 μL CCK-8溶液，置于37℃孵育2 h，然后用酶标仪检测450 nm 条件下溶液的吸光度值。每组实验均重复3 次。

1.2.5 克隆形成实验检测细胞增殖能力 取100个转染后的KYSE170 细胞接种于6 孔板培养基上，在6 孔板中加入2 mL 含有10%胎牛血清的新鲜培养基。每3 天更换1 次培养基，14 d 后用4%多聚甲醛固定细胞并进行结晶紫染色，手动计算肉眼可见的克隆数目。

1.2.6 划痕愈合实验检测细胞迁移能力 收集对数生长期的KYSE170 细胞，接种于6 孔板内，并在6 孔板的背面划5 条平行线用作标记，48 h 后用10 μL 枪头在细胞中划2 条平行直线，与6 孔板背面的直线垂直。用0.01 M PBS 溶液轻轻漂洗细胞，然后加入2 mL 无胎牛血清的RPMI 1640 培养基，分别在0 h、48 h 将培养板置于倒置显微镜下观察细胞向划痕中间迁移的距离并拍照记录，每组实验设置3 个平行孔，且实验重复3 次。

1.2.7 Transwell 实验检测细胞侵袭能力 取转染了si-circ 或si-NC 的对数生长期KYSE170 细胞种植于Transwell 小室的上室，下室中加入600 μL 含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培养基。常规培养48 h 后，用棉签轻轻擦净上室中的细胞，用0.01 M PBS 溶液清洗后进行结晶紫染色，将Transwell 小室放置于倒置显微镜下观察并拍照，随机观察5 个视野，计算穿膜的细胞数。本实验重复3 次。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（）表示，比较用t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hsa_circ_0076535 在ESCC 组织及细胞内高表达情况

分离ESCC 细胞系（Het-1A、Eca109、KYSE170）、ESCC 患者肿瘤组织及相应的癌旁组织内总RNA，通过qRT-PCR 对组织及细胞内hsa_circ_0076535 的表达水平进行检测。实验结果表明，与Het-1A 细胞相比，Eca109、KYSE170 细胞内hsa_circ_0076535 呈现高表达（见图1A），且在ESCC 患者癌组织内同样显示高表达（见图1B）（P<0.05）。hsa_circ_0076535 在ESCC 的发生过程中可能发挥着一定作用，然而这种作用目前并不明确。

图1 hsa_circ_0076535 在ESCC 细胞系及组织内的表达水平

2.2 下调hsa_circ_0076535 能够抑制ESCC 细胞增殖

设计并合成si-circ 干扰序列用于体外研究hsa_circ_0076535 对ESCC 细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。将两种si-circ（si-circ_1#、si-circ_2#）片段及si-NC 片段分别转染进KYSE170 细胞内，转染48 h 后通过qRT-PCR 对细胞内hsa_circ_0076535表达水平进行检测。如图2A 所示，检测结果发现si-circ_1#具有较好的沉默效果，因此在接下来的实验中选取si-circ_1#用于干扰目的基因的表达，随后通过CCK-8 实验对KYSE170 细胞的增殖活性进行检测，分别在转染后0 h、24 h、48 h、72 h 及96 h 时间点检测细胞在450 nm 时的吸光度值，结果发现下调hsa_circ_0076535 的表达能够抑制KYSE170 细胞增殖，且抑制效果随时间的增加而增加（见图2B）。此外，克隆形成实验同样证明下调细胞内hsa_circ_0076535 的表达水平能够抑制细胞增殖（见图2C）。总之，通过CCK-8 及克隆形成实验证明下调ESCC 细胞内hsa_circ_0076535 的表达水平能够抑制细胞增殖。

图2 下调ESCC 细胞内hsa_circ_0076535 的表达水平对细胞增殖的影响

2.3 下调hsa_circ_0076535 能够抑制ESCC 细胞迁移、侵袭

为了检测hsa_circ_0076535 对ESCC 细胞迁移及侵袭能力的影响，在KYSE170 细胞中转染了si-circ 或si-NC 核苷酸片段，通过划痕愈合实验及Transwell 实验来验证下调hsa_circ_0076535 对KYSE170 细胞的迁移及侵袭能力的影响。划痕愈合实验结果表明，细胞转染48 h 后，转染si-circ组细胞的迁移距离明显小于转染si-NC 组细胞及对照组细胞（P<0.05），下调hsa_circ_0076535 能够显著抑制KYSE170 细胞的迁移能力（见图3A）。同样的Transwell 实验结果表明，转染了si-circ 的KYSE170 细胞转移至下室中的数目最少（见图3B）。综合上述实验结果可知，下调ESCC 细胞中hsa_circ_0076535 表达水平能够显著抑制细胞的迁移及侵袭能力。

图3 检测hsa_circ_0076535 对ESCC 细胞迁移及侵袭能力影响的划痕愈合实验及Transwell 实验

3 讨论

circRNAs 首次发现于1976 年的植物中，并被证明能够编码亚病毒因子［11］。近些年随着RNA-seq技术及生物信息学的发展，逐渐证明了circRNAs的丰度及多样性，并在不同的发育阶段和生理条件下揭示了circRNAs 的动态表达模式，且还发现了更多circRNAs 的功能，例如在蛋白质复合物的组装中充当支架，调节亲本基因的表达，充当miRNA 海绵［12-13］。

随着研究的深入，逐渐积累的证据表明circRNAs 在许多疾病的发展过程中扮演着重要的角色［14-15］，由于其具有保守性、丰度及组织特异性的特点，使其可能在某些疾病分子中充当特殊的分子标志物，包括肿瘤［16-17］，例如研究报道环状RNA hsa_circ_0014130 可能是潜在的非小细胞肺癌的临床生物标志物［18］。癌症是一种复杂的动态生物学过程，ESCC 也不例外，且多个基因被证明与ESCC 有关，例如lncRNA 中的NEAT1［19］、HOTAIR［20］等。然而目前还不清楚circRNA 是否与ESCC 相关。

本研究中证明了hsa_circ_0076535 在ESCC 组织及细胞系内高表达，这预示着hsa_circ_0076535可能与ESCC 存在一定的联系。笔者利用siRNA技术干扰ESCC 细胞内hsa_circ_0076535 的表达水平，用于研究hsa_circ_0076535 与ESCC 细胞表型的关联。CCK-8 实验结果显示，与转染si-NC 组的细胞及对照组细胞相比，转染si-circ 组ESCC 细胞增殖能力显著下降，且随时间的增加增殖能力降低更显著。同样的克隆形成实验同样证明，下调hsa_circ_0076535 在ESCC 细胞内的表达能够显著抑制细胞的增殖能力。此外划痕实验结果显示，下调hsa_circ_0076535 的表达能够显著减小ESCC细胞的迁移距离及抑制细胞迁移。Transwell 实验结果同样显示，抑制ESCC 细胞内hsa_circ_0076535 的表达能够显著降低转移的细胞数目，显著抑制ESCC 细胞的侵袭能力。

综上所述，本研究结果证明，下调ESCC 细胞内hsa_circ_0076535 的表达水平能够抑制细胞增殖、迁移及侵袭，且本研究首次在ESCC 中阐述了circRNAs 的作用，拓展了ESCC 的认识，并为寻找新的ESCC 潜在生物标志物奠定了基础。