不同秸秆还田模式土壤微生物多样性分析

杨冬静,谢逸萍,张成玲,马居奎,唐 伟,陈晶伟,孙厚俊

(江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/农业农村部 甘薯生物学与遗传育种重点实验室,江苏 徐州 221131)

随着农业生产的发展,农作物秸秆数量逐渐增多,但农作物秸秆作为生活燃料的用量随农村生活水平的提高而逐渐减少,且长期以来对农作物秸秆没有形成专业化、产业化的处理模式而使其被充分利用,大量秸秆在田间地头被就地焚烧,由此造成资源浪费和环境的重度污染,严重威胁着农业的可持续发展。秸秆还田既可充分利用秸秆资源,又可减轻焚烧秸秆对生态环境的负面影响,是发展有机可持续农业的有效途径[1,2]。已有的研究表明,还田后的秸秆腐解对于促进作物生长、改善和提高土壤质量具有重要作用[3]。曹志平等的研究表明还田秸秆的腐解液可以对病原菌产生化感作用，从而减轻下茬作物病害的发生[4,5]；但李洪林等研究发现秸秆还田可以促进病原菌的积累,增强连作障碍[6,7]。此外,Yu等研究发现,秸秆还田提高了土壤微生物的数量和活性[8],而土壤微生物数量及活性的提高又加速了秸秆的腐解[9],表明秸秆还田与土壤微生物之间是相互促进相互影响的。

采用传统的微生物分离方法分离出的土壤微生物种类只占土壤微生物种类总数的0.1%～1.0%[10]。采用高通量测序技术方法能够更加全面地反映土壤微生物的组成情况,故该方法在微生物群落多样性研究中得到了越来越广泛的应用。本文以江苏省农业科学院稻麦轮作模式下纹枯病发生消长规律试验为依托,采用高通量测序的方法,对旋耕条件下不同秸秆还田方式的麦田土壤微生物多样性进行了研究,旨在为通过优化秸秆还田方式来调节土壤微生态系统和提高作物产量等提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集和处理

土壤样品于2019年5月13日采自江苏省泗洪县石集镇稻米文化馆秸秆还田试验地,统一采用旋耕方式，设置4种秸秆还田方式处理：处理A，稻麦秸秆均不还田(命名为Sample1);处理B，稻麦秸秆全量还田(命名为Sample2);处理C，水稻秸秆全量还田(命名为Sample3);处理D，小麦秸秆全量还田(命名为Sample4)。采用5点取样法,采集土层深度0～5.0 cm的表层土壤,晃动震落小麦根部松散的土壤后,使用无菌刷子从根部收集残留土壤,将同一样方5点取样的土壤样本等量混匀作为1个样品；每种还田方式处理设置3个重复,共12份土壤样品,分别编号为Sample1-R1、Sample1-R2、Sample1-R3、Sample2-R1、Sample2-R2、Sample2-R3、Sample3-R1、Sample3-R2、Sample3-R3、Sample4-R1、Sample4-R2和Sample4-R3。将采集好的土壤样品置于冰上运输至实验室,经液氮速冻后,置于-80 ℃冰箱保存或采用干冰寄送至镇江蔚绿生物科技有限公司进行测序。

1.2 土壤微生物的测序

利用CTAB法抽提土壤基因组的DNA,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。将纯化的DNA进行PCR扩增,将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测；使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(为AXYGEN公司的产品)切胶回收PCR产物,用Tris_HCl洗脱后采用2%琼脂糖电泳检测回收的PCR产物。采用Truseq DNA kit (为美国Illumina公司的产品)进行文库构建,用Illumina PE250测序平台检测16S区,扩增引物序列515F为5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′；907R为5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。真菌ITS扩增引物序列ITS1F为5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；ITS2R为5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

1.3 生物信息分析流程

对经Illumina PE测序得到的PE reads,首先根据overlap关系进行拼接,同时对序列质量进行质控和过滤；在区分样本后进行OTU (Operational Taxonomic Unit)聚类分析和物种分类学分析；基于OTU聚类分析结果,可以对OTU进行多种多样性指数的分析以及对测序深度进行检测。基于分类学信息,可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。利用基因序列分类单元OTU指数和Chao指数表征群落中物种的数量,利用Shannon指数、Simpson指数综合评估群落中物种的丰富度和均匀度，采用主成分分析方法分析样本间OTU的相似性。

2 结果与分析

2.1 土壤样品细菌测序结果及测序深度评估

对12个土壤样品细菌的16S片段进行测序,经过优化过滤低质量序列,共得到586423条优质序列,平均长度为376.48 bp(表1)。

表1 测序数据的统计分析结果

2.2 土壤样品中细菌群落丰度与α多样性分析

随着序列数的增大,4个处理的细菌稀释曲线均基本趋于平缓,说明测序数据量渐进合理,更多的数据量只会产生少量新的物种(OTUs)。

供试土壤样品序列经拆分、去冗余后，对获得的高质量序列在97%的相似度下进行归类和OTU划分,4个还田方式处理一共获得了4699个OTUs,平均分别获得了2952、2831、3109、2772个OTUs；与处理A相比,处理C的平均OTU数明显增加,表明水稻秸秆还田提高了土壤细菌的多样性；但是对各组处理数据进行分析，发现群落的均匀度不够。采用体现群落丰富度的Chao指数、Shannon指数和Simpson指数以及表征群落覆盖度的Coverage指数进行群落的α多样性分析，结果见表2。从表2可以看出,处理B和处理C各重复的Shannon指数均高于处理A,表明与稻麦秸秆均不还田相比,稻麦秸秆全量还田和水稻秸秆全量还田均对土壤中细菌多样性的促进作用较强,但各处理间数据无显著性差异;与处理A相比,处理D的Shannon指数未见明显升高,说明小麦秸秆还田对土壤中细菌多样性的促进作用不明显。

表2 土壤细菌测序及α多样性分析结果

2.3 土壤样品中细菌群落结构组分分析

在不同秸秆还田方式下根围土壤细菌门水平的优势菌群包括变形杆菌门Proteobacteria、绿弯菌门Chloroflexi、放线菌门Actinobacteria、酸杆菌门Acidobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、芽单胞菌门Gemmatimonadetes、浮霉菌门Planctomycetes、硝化螺旋菌门Nitrospirae、疣微菌门Verrucomicrobia等9个门(图1A)。在所有样品中,变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度最高；在4种还田方式下变形菌门的丰度平均值分别为32.6%、33.6%、33.5%和34.2%；与稻麦秸秆均不还田的对照相比,在其他几种秸秆还田方式下变形菌门的丰度均有所提高,但在处理间无显著性差异;门水平的其他几种优势菌群也有所变化,但是在处理间均无显著性差异。

在不同秸秆还田方式下根围土壤细菌属水平的群落优势菌群包括厌氧绳菌属Anaerolineaceae_uncultured、Subgroup6_norank、SC-I-84_norank、芽单胞菌属Gemmatimonas、KD4-96_norank、Gemmatimonadaceae_uncultured、Gaiellales_norank、Nitrosomonadaceae_uncultured、Arenimonas、Mucilaginibacter、类诺卡氏属Nocardioides、罗思河小杆菌属Rhodanobacter、链霉菌属Streptomyces、Blastocatellaceae (Subgroup4)_uncultured、藤黄单胞菌属Luteimonas、浮霉菌属Planctomycetaceae_uncultured、马赛菌属Massilia、Tepidisphaeraceae_norank、Anaerolinea、Subgroup7_norank、Humibacillus、Marmoricola、Comamonadaceae_uncultured、C0119_norank、Bryobacter、Xanthomonadales Incertae Sedis_uncultured等26个属(图1B),其中,7个属因在分类学数据库分类学谱系的中间等级,没有科学名称,所以用norank作为标记。在26个优势属中,4个处理下厌氧绳菌属Anaerolineaceae_uncultured的丰度最高,分别为8.3%、7.7%、7.4%和7.9%；与不还田对照相比,3种不同秸秆还田方式下厌氧绳菌属的丰度有所降低,但无显著性差异。优势属分析结果表明,在不同秸秆还田方式下其他优势细菌属水平在一定程度上发生了变化。

图1 4种秸秆还田方式下根围土壤细菌门水平和属水平的群落丰度

2.4 4种还田方式下根围土壤细菌群落的β多样性分析

对4种秸秆还田方式下麦田土壤中细菌OTU的组成进行主成分分析,从图2可以看出,稻麦秸秆均不还田的空白对照与稻麦秸秆全量还田、水稻秸秆全量还田以及小麦秸秆全量还田处理之间的距离较远,说明在不还田和还田处理间土壤细菌OTU组成的差异较大,细菌群落结构也差异较大。而在3个秸秆还田方式处理之间的距离较近,说明在秸秆还田下土壤细菌OTU组成的差异较小,细菌群落结构也相近。

图2 在4种秸秆还田方式下麦田土壤中细菌OTU组成的主成分分析结果

2.5 4种秸秆还田方式下根围土壤细菌群落组成及差异物种

差异物种分析结果(图3和表3)表明：稻麦秸秆均不还田对照组Sample1的差异物种为放线菌目Gaiellales、蓝细菌Cyanobacteria、铬还原间孢囊菌属Intrasporangium等14个物种,其中放线菌目Gaiellales的丰度最高，为4.41%；在稻麦秸秆全量还田处理下差异物种为Longimicrobia纲、Longimicrobiales目、Londimicrobiaceae科等20个物种,其中Longimicrobia纲的丰度最高，为3.76%;在水稻秸秆全量还田处理下差异物种为Rhodospirillales红螺菌目、Rhodosppirillaceae红螺菌科、Inquilinus属等15个物种,其中Rhodospirillales的丰度最高，为4.37%;在小麦秸秆全量还田处理下差异物种有Mucilaginibacter、Cstemulisporaceae、Bacteroidetes_vadinHA17等18个物种,其中Mucilaginibacter属的丰度最高，为4.21%;在4种不同秸秆还田方式下细菌群落的差异物种丰度为1.51%～4.84%。

图3 在4种还田方式下根围土壤优势细菌及其丰度

表3 在4种还田方式下根围土壤中显著性差异细菌的LDA分值

续表3：

2.6 土壤样品真菌测序结果及测序深度评估

对12个土壤样品真菌的ITS片段进行测序,经过优化过滤低质量序列,共得到了553719条优质序列,平均长度为255.66 bp(表4)。

表4 测序数据统计分析结果

2.7 土壤样品中真菌群落丰度与α多样性分析

随着序列数的增大,在4种秸秆还田方式下的土壤真菌稀释曲线均基本趋于平缓,说明测序数据量渐进合理。供试土壤样品序列经拆分、去冗余后对获得的高质量序列在97%的相似度下进行归类和OTU划分,4个还田方式处理一共获得了1674个OTUs,处理A、B、C、D平均分别获得了572、558、498、699个OTUs(表5)。与处理A相比,处理D的OTU数量提高了,相应地其Shannon指数和Simpson指数也提高了,表明麦秸还田提高了土壤真菌的多样性。其他两种还田方式处理也在一定程度上改变了土壤真菌的多样性。

表5 土壤样品真菌测序及α多样性分析结果

2.8 土壤样品中真菌群落结构组分分析

在不同秸秆还田方式下根围土壤真菌门水平的主要类群为Fungi_norank、子囊菌门Ascomycota、担子菌门Basidiomycota、Unclassified、毛霉门Mucoromycota,其中有大量未知真菌的丰度值在43.5%～48.7%;其次是子囊菌门真菌,其丰度值为31.4%～34.6%。

在不同秸秆还田方式下根围土壤真菌属水平的主要类群为Fungi_norank、Bolbitiaceae_norank、葡萄孢属Botrytis、Unclassified、链格孢属Alternaria、Apodus、Paraglomerales_norank、青霉属Penicillium、 黄丝曲霉属Talaromyces、帚枝霉属Sarocladium、子囊菌属Ascomycota_norank、线黑粉酵母属Filobasidium、小羊蹄菌属Microdochium、附球菌属Epicoccum、镰刀菌属Fusarium、Tomentellopsis、Hypholoma属、掷孢酵母属Sporobolomyces、芽枝霉属Cladosporium、Basidiomycota_norank、Lasiosphaeriaceae_norank、曲霉属Aspergillus、丝枝霉属Aphanocladium、球腔菌属Phaeosphaeria、木霉属Trichoderma、黑孢属Nigrospora、Simplicillium、旋孢腔菌属Cochliobolus等28个属(图4)。

图4 在4种秸秆还田方式下土壤根围真菌门水平和属水平的群落丰度

2.9 在4种秸秆还田方式下根围土壤真菌群落的β多样性分析

对4种秸秆还田方式下麦田土壤中真菌OTU的组成进行主成分分析,从图5可以看出,处理A与处理B、处理C间的距离较近,说明土壤真菌OTU组成相近,真菌群落结构也相近;而处理D与其他3个处理间的距离较远,说明土壤真菌OTU组成差异较大,真菌群落结构差异也较大。

图5 在4种秸秆还田模式下麦田土壤中真菌OTU主成分分析结果

2.10 在4种秸秆还田方式下根围土壤真菌群落组成及差异物种

从图6可以看出,在稻麦秸秆均不还田的对照土壤中真菌有枝孢属Cladosporium、煤炱菌科Cladosporiaceae、小毛菌属Hirsutella等14个差异物种,其中枝孢属的丰度最高,为4.12%;在稻麦秸秆全量还田的土壤中真菌有田头菇属Agrocybe、蜡蚧菌属Lecanicilliun、葡萄座腔菌科Botryosphaeriales等6个差异物种,其中田头菇属的丰度最高,为3.5%;在水稻秸秆全量还田的土壤中真菌有粪壳菌纲Sordariomycetes、粪壳菌目Sordariales和毛球壳科Lasiosphaeriaceae等15个差异物种,其中粪壳菌纲的丰度值最高,为5.19%；在小麦秸秆全量还田的土壤中真菌有髮菌科Trichocomaceae、黄丝曲霉属Talaromyces、Striatibotrys属等3个差异物种,其中髮菌科的丰度值最高，为4.63%(表6)。

表6 在4种秸秆还田方式下根围土壤中显著性差异真菌的LDA分值

图6 在4种秸秆还田方式下根围土壤优势真菌种类及差异物种

3 小结与讨论

土壤微生物的多样性和群落结构可以在一定程度上反映农田生态系统的基本情况。保持土壤微生物群落多样性及其驱动下的生态过程多样性是农业生产赖以生存的基础[11]。在秸秆还田条件下土壤中微生物群落结构变化的研究还不够系统。一般认为长期保护性耕作(免耕、少耕和秸秆还田等)能改善微生物的群落结构,提高土壤微生物的多样性[12,13],但也有部分研究结果指出短期耕作并未影响微生物的群落结构和多样性[14,16]。

本研究的土壤细菌多样性分析结果表明：在4种还田方式下变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度最高；与稻麦秸秆均不还田的对照相比,其他几种秸秆还田方式下变形菌门的丰度均有所提高,门水平的其他几种优势菌群也有所变化；在4种还田方式下,属水平的共有26个优势菌群,其中厌氧绳菌属Anaerolineaceae_uncultured的丰度最高；与不还田对照相比,3种秸秆还田方式下厌氧绳菌属的丰度有所降低,属水平的其他优势菌群也在一定程度上发生了变化,但这些变化均无显著性差异。主成分分析结果表明：稻麦秸秆均不还田的对照与3种秸秆还田方式处理间的距离较远,说明还田可以在一定程度上改变土壤细菌的群落结构；在不同处理之间存在14～20种显著差异性细菌物种。

本文的土壤真菌多样性分析结果表明：麦秸还田提高了土壤真菌的多样性,其他两种还田方式也在一定程度上改变了土壤真菌的多样性；在4种还田方式下真菌门水平的优势菌群包括子囊菌门、担子菌门、毛霉门和一些未分类和未知真菌,属水平的优势菌群共有28种。主成分分析表明：小麦秸秆全量还田对土壤真菌群落结构的影响较大,在不同还田方式处理间存在3～14种显著差异性物种。在本研究中,4种秸秆还田方式从2017年秋季开始实施,至2019年5月小麦收获前期采集土样,历时近2年,属于短期不同秸秆还田模式下的土壤微生物多样性研究,本研究结果表明不同秸秆还田方式改变了土壤中细菌和真菌的群落结构和差异物种,说明秸秆还田在一定程度上改变了土壤微生物的多样性、菌群的相对丰度以及差异物种,但是由于秸秆还田时间较短,在各处理间未见显著性差异,这与Petersen等学者[14,15]的研究结果相符。鉴于秸秆还田对土壤微生物多样性影响的复杂性,今后还需要进一步开展该方面的长期定位试验。