印度梨形孢接种对丁香罗勒气体交换、生物量累积及其次生代谢物含量的影响

刘江澜，刘 晨，董 桥，姚 稳，吴 楚

(长江大学 园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

进入21世纪以来，糖尿病越来越成为威胁人类健康的重大慢性疾病。随着患病率的增加，人们生活水平以及医疗水平的提高也推动了我国糖尿病用药市场需求的增长，目前我国已成为全球最重要的糖尿病药物市场。鉴于糖尿病对人体健康的危害，人们一直在探索最安全有效的药品(Pradhan等[1],2018;Zhang等[2],2018;Hester等[3],2019)。从植物中提取抗糖尿病的药物包括熊果酸(ursolic acid)和齐墩果酸(oleanolic acid)2种次生代谢物。

熊果酸为植物中所提取的三萜化合物，是PTP 1B活动的强力抑制剂。研究表明，熊果酸能够呈现很强的抗高血糖效果。通过与GLUT4转移到细胞膜以及GLUT4合成有关的胰岛素信号转导，熊果酸可以促进葡萄糖的吸收(Castro等[4],2015)。此外，熊果酸还可以改善高血糖引起的足状突细胞(podocyte)伤害(Xu等[5],2017)。另一项研究中，熊果酸作为胰岛素促分泌素(insulin secretagogue)和胰岛素模拟物质(insulin mimetic)，通过介导钙离子与激酶的对话进而调节糖的平衡。熊果酸还具有其他药用价值：抗肿瘤、肝脏保护与移植、消炎、抗溃疡、抗细菌和病毒、抗高血脂以及减轻抗肿瘤药物阿霉素(Adriamycin)引起的肾脏伤害(Zhou等[6],2017;Park等[7],2018;Yin等[8],2018;Gou等[9],2019)。

齐墩果酸是一种天然的五环三萜化合物，是很多皂角苷的糖苷配基，也是一种强力抗氧化剂。在抗胰岛素糖尿病模型中，齐墩果酸可以促进胰岛素信号转导，抑制氧化胁迫诱导的肝脏胰岛素抗性和糖质新生(gluconeogenesis)，在此过程中，齐墩果酸也涉及ERK的磷酸化和对线粒体功能的保护效应(Nazaruk等[10],2014)。齐墩果酸抗糖尿病的生物化学基础已经清楚(Castellano等[11],2013)，它可以促进胰岛素响应，保护β细胞的功能和生存，显著降低血糖，控制体重下降并保护各种糖尿病并发症。此外，齐墩果酸可以保护肝脏因有毒化合物引起的肝脏损伤，还具有抗癌、消炎和抗高血脂的功能(Lin等[12],2016;Park等[7],2018;Wan等[13],2017)。因此，齐墩果酸似乎是一种非常重要的功能食品，当其适量服用时可以控制糖尿病。

丁香罗勒(OcimumgratissimumL.)是唇形科罗勒属植物，为一年生草本，外形美观，香气宜人，在我国湖北、湖南、广东、广西等省份多有栽培。在欧美国家是一种常见的调料蔬菜，被称为“香草之王”(张丽萍等[14]，2017)。丁香罗勒不仅是香料植物，而且还是重要的药用植物，成熟时间较短，有利于试验研究，可全草入药，其生物活性成分具有一定的抗菌性(莫小路等[15]，2009)。丁香罗勒中含有熊果酸和齐墩果酸(Rao等[16],2013;Casanova等[17],2014)。

印度梨形孢(Piriformasporeindica)是从印度沙漠植物中分离出来的一种有益的内生真菌，它在寄主植物体内所形成的共生结构与丛枝菌根(AM)真菌所形成的丛枝和泡囊结构不同(Rafiqi等[18],2013)，但它具有AM真菌所不具备的特点——非活体营养(Oelmuller等[19],2009)，同时具有AM真菌所具有的一切生理和生态功能(Varma等[20],2013)。正因为它具有这样的特点，人们可以把它当作生物肥料、生物保护剂、生物调节剂、生物除草剂和植物生长促进剂使用，因此，它将在农业和林业上具有广阔的实际应用前景。虽然人们对其展开了广泛的研究，但目前人们仍不清楚印度梨形孢与植物互利共生的分子对话的机理。印度梨形孢可以增加许多药用植物的生物量，还可以促进寄主的次生代谢(Satheesan等[21],2012；Kumar等[22],2013)。印度梨形孢不仅可以增加积雪草(Centellaasiatica)的生物量，还可以增加积雪草皂甙(asiaticosides)的生物合成。在受到印度梨形孢侵染的积雪草中，积雪草皂苷生物合成途径中关键酶鲨烯合成酶(squalene synthase)和β-香树脂素合成酶(β-amyrin synthase)的转录增加。在药用植物Linumalbum的细胞培养中，印度梨形孢可以促进抗癌药物鬼臼毒素(Podophyllotoxin)的生物合成(Baldi等[23],2010；Kumar等[24],2013)。在Linumalbum中，印度梨形孢还可以促进木酚素(lignan)的生物合成。在茴香(Foeniculumvulgare)、百里香(Thymusvulgaris)，印度梨形孢与之共生，能促进其精油的生物合成(Dolatabadi等[25-26],2011)。此外，其他真菌也具有这种作用，如Sebacinavermifera(Dolatabadi等[25-26],2011)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)(De Ascensao等[27],2003)。

鉴于上述事实，本文以印度梨形孢和丁香罗勒为试验材料进行研究，旨在探讨印度梨形孢对丁香罗勒的生长及其熊果酸和齐墩果酸的生物合成的影响，以便将印度梨形孢用于植物促进抗糖尿病药物的生物合成。

1 材料与方法

1.1 供试材料

将培养基质进行高压灭菌，冷却后装入直径15 cm测塑料盆中，在将消毒后的丁香罗勒种子播种于盆内，待小苗出土后，适当间苗。待小苗长到3片真叶时，将印度梨形孢接种于盆内(每盆10 mL印度梨形孢悬浮液)，对照接种10 mL的灭活的印度梨形孢悬浮液。待接种1个月后，去丁香罗勒的根系进行镜检，观察印度梨形孢对其根系的侵染。剩余的小苗继续培养，直到花蕾出现为止。在此期间，在天气晴朗的时候，测定其光合速率和荧光参数。脱盆取出小苗，用自来水清洗干净，带回实验室进行处理：取其根系，以根系扫描仪测定根系组成各参数；将植株放入烘箱内烘至恒重，然后测定植物的地上和地下的生物量。取其叶片和茎干，以分光光度法测定熊果酸和齐墩果酸的含量。

1.2 试验方法

1.2.1 叶片光合作用参数的测定 选取健康的丁香罗勒叶片，用Li-cor公司(USA)生产的Li-6400便携式光合仪标准叶室，在天气晴好的9：00～12：00采用Li-6400-02B红蓝光光源测定其净光合速率、蒸腾速率和气孔导度等参数。

1.2.2 叶绿素荧光参数的测定 叶绿素荧光采用便携式叶绿素荧光仪测定(型号：Junior-PAM，由德国Walz公司生产)；在测定时，PAR设置为190 μmol/(m2·s)。

1.2.3 次生代谢物含量的测定 熊果酸(CAS：77-52-1)和齐墩果酸(CAS：508-02-1)标准品从Sigma-Aldrich公司购买。标准品处理：配置浓度1 mg/mL标准品，充分溶解，过0.22 μm有机滤膜，取10 μL上样。样品处理：样品和95%乙醇按照料液比1∶15，超声波提取30 min，过滤膜，取10 μL上样。检测条件：流动相乙腈∶0.2%乙酸=85∶15，柱温25 ℃，检测波长210 nm。高效液相色谱仪为美国安捷伦Agilent 1260。

1.3 统计分析

所采集的数据使用SPSS 17.0软件进行分析处理，多重比较以ANOVA的LSD进行检验，以P=0.05为显著性检验水平。

2 结果与分析

2.1 印度梨形孢接种对丁香罗勒光合作用的影响

丁香罗勒接种印度梨形孢后，其各项光合参数皆有明显的影响(图1)。接种后的丁香罗勒植株对比未接菌的植株净光合速率(Pn)和蒸腾速率(Tr)都有提高，其中净光合速率增加显著(图1)。气孔导度(Gs)对比未接菌的植株而言则明显下降(图1)。

2.2 印度梨形孢接种对丁香罗勒叶绿素荧光参数的影响

接种梨形孢后，丁香罗勒的叶绿素荧光参数也受到了相应的影响(图2)。其中荧光参数Y(Ⅱ)值、qP值、Fv/Fm值和qL值受影响较小，均为小幅度下降(图2)。荧光参数ETR则在接菌后下降较为明显(图2)。

而对于荧光参数Y(NO)而言，接菌后的丁香罗勒植株则比未接菌的植株数值有较为明显的上升(图2)。

图2 印度梨形孢接种对丁香罗勒叶绿素荧光参数的影响

2.3 印度梨形孢接种对丁香罗勒根系发育和生物量累积的影响

从图3的数据可分析得到，接种印度梨形孢后，丁香罗勒的根系生长发育较未接种前无明显差异。对于根系总长度而言，接菌后的植株较接菌前总长度有小幅度上升。类似地，对于根系总表面积而言，接菌后的植株较接菌前植株根系总表面积的上升幅度较小。而相反地，在根系总体积方面，接菌后的植株根系总体积较接菌前则有小幅度的下降。

图3 印度梨形孢接种对丁香罗勒根系生长发育的影响

如图4所示，在接种印度梨形孢后，对丁香罗勒的生物量累积也有一定的影响。

图4 印度梨形孢接种对丁香罗勒生物量累积的影响

对于地上部分和全株的生物量而言，有较为明显的差异。接菌后的植株较接菌前的植株地上部分生物量和全株的生物量均有明显上升。在地下部分的生物量来说，接菌前后并无明显变化。

2.4 印度梨形孢接种对丁香罗勒次生代谢物含量的影响

在接种印度梨形孢后，丁香罗勒植株不同部位的齐墩果酸和熊果酸含量的变化存在差异，且整体含量较未接菌前呈下降趋势(图5)。对于叶片中熊果酸的含量而言，接菌后的植株较未接菌的植株，含量有明显的下降。

而对于茎中熊果酸的含量而言，接菌后的植株熊果酸的含量下降幅度较小，差异不明显(图5)。同样地对于齐墩果酸的含量而言，接菌后的植株较未接菌的植株，叶片中的含量有明显的下降，而茎中的含量而则下降幅度较小，无明显差异(图5)。

图5 印度梨形孢接种对丁香罗勒次生代谢物含量的影响

3 讨论

如今，印度梨形孢已被证明能够定殖于多种植物种类(Franken[28],2012；Unnikumar等[29],2013)，且能够对其寄主植物的生长发育产生促进作用。在本试验研究中，印度梨形孢也能定殖于丁香罗勒中(数据未显示)。接种印度梨形孢后的丁香罗勒植株较未接种的对照组，在各项试验数据中都反映出了不同程度的影响。从荧光参数来看，虽然接种印度梨形孢后，对丁香罗勒的侵染并没有显著改变其叶绿素荧光参数Y(Ⅱ)、qP、Fv/Fm和qL(图2)，但荧光参数Y(NO)却在接菌后有明显的提高(图2)，而ETR参数有明显下降(图2)。这可能是植物自身利用非光化学猝灭，从而减轻受胁迫伤害的一种保护机制(贾舟楫等[30]，2019；方怡然等[31]，2019)。所以印度梨形孢可能会对丁香罗勒的抗胁迫能力产生有一定的帮助。

植物进行光合作用是其生理生长的基础，其光合作用能力可以反映出其生长情况(Gururani等[32],2015)。接种印度梨形孢后，虽然丁香罗勒气孔导度有所下降下降(图1)，但净光合速率和蒸腾速率皆有明显提高(图1)，这证明印度梨形孢提升了植株的光合作用能力，使之干物质累积加快，从而加强植株的生长发育能力。

植物根系是为其提供营养的重要器官，印度梨形孢对玉米、烟草、欧芹等植物的侵染可促进其根系生长与生物量的累积(Bagde等[33],2011)。本试验对丁香罗勒接种印度梨形孢后，虽然对根系总体积的影响并不明显(图3)，但其对根系总长度和根系总表面积都有一定的提升(图3)，应该是受其光能利用效率提高的影响。这可以使植物更好地吸收水和营养，促进自身生长发育和生物量的累积。地下生物量累积在接种前后并无明显差异，但地上部分生物量较之前有明显的增加(图4)，这表明印度梨形孢定殖可以提高丁香罗勒的生物量累积。此试验结果与其他试验结果一致(Bagde等[33],2011)。

一些试验结果表明，菌根真菌和内生真菌孢侵染植物可以提高植物次生代谢物的含量。例如，丛枝菌根真菌Rhizophagusintraradices与丁香罗勒共生可以促进其迷迭香酸(Rosmarinic acid)生物合成途径中的关键基因的表达而提高迷迭香酸的含量(Battini等[34],2016)。3种内生真菌Aspergillusterreus、Penicilliumoxalicum、Sarocladiumkiliense可以促进睡茄(Withaniasomnifera)中睡茄素A(withanolide A)的含量(Kushwaha等[35],2019)。印度梨形侵染黄花蒿(Artemisiaannua)，可以提高青蒿素(artemisinin)的含量(Arora等[36],2016)，也可以促进向日葵(Helianthusannus)种子油的产量(Bagde等[33],2011)。然而，在本研究中，接种印度梨形孢后的丁香罗勒植株，熊果酸和齐墩果酸整体含量都有所下降：在茎中含量下降明显，而叶中含量下降并不明显(图5)。这一试验结果与上述试验结果不一致。导致这种试验结果不一致的原因可能是印度梨形孢侵染抑制了熊果酸和齐墩果酸的生物合成途径中的某种关键的酶的表达或活性。熊果酸和齐墩果酸均起源于鲨烯(squalene)或2，3-氧化鲨烯(2,3-oxidosqualene)，只是经过α-香树脂素合成酶(α-amyrin synthase)和β-香树脂合成酶(β-amyrin synthase)分别合成α-香树脂素(α-amyrin)和β-香树脂(β-amyrin)，它们再分别转化成熊果酸和齐墩果酸(Kashyap等[37],2016)。因此，印度梨形孢侵染对熊果酸和齐墩果酸含量的影响是一致的。这表明印度梨形孢的侵染对其生物合成的抑制作用在其合成途径的上游。

本试验可知，印度梨形孢侵染丁香罗勒可促进其生物量的累积而减少熊果酸和齐墩果酸的含量。