分子标记辅助聚合多抗番茄砧木材料的筛选

杜文丽，林 文，钟开勤，陈继兵，陈中钐， 高 山

(福州市蔬菜科学研究所，福建 福州 350111)

番茄是一种典型的喜温性蔬菜作物，因其较高的营养价值且兼具美容保健功效，现已成为露地、塑料大棚、日光温室及各类保护地设施蔬菜的主栽物种[1]。近几年，各种病害的流行发生成为制约番茄生产发展的最重要原因，病虫害交叉侵染严重，连作障碍使番茄病虫害发生程度不断攀升，而保护地栽培受设施条件的限制导致轮作难以实施，使番茄的生产效益提高有限[2-3]。土传病害如青枯病、枯萎病和根结线虫等的发病率呈逐年上升趋势，以番茄青枯病为例，该病广泛分布于热带、亚热带及温带地区，在我国长江以南各地尤其是华南地区经常大面积暴发，重病田块的死株率达80%以上，使番茄减产超过60%[4-6]。近年来，番茄砧木抗病育种多集中于一种病害，苏银玲等简要概述了当前国内外番茄抗病育种、生物防治、农业防治和化学防治等的研究进展，提出了综合治理防治番茄叶霉病的理念[7]。莫豪葵等[8]利用3个不同的接穗品种进行嫁接试验，确定了其高抗青枯病特性以及较强的嫁接亲和性与共生性。褚新培等对枯萎病病原菌采用形态学和分子生物学等方法进行鉴定，鉴定了多个番茄砧木材料的抗枯萎病能力[9]。针对聚合多抗番茄砧木育种的报道鲜见。

实践证明：通过选择聚合多抗基因高抗砧木进行嫁接栽培是防止蔬菜土传病害大面积暴发、克服设施番茄连作障碍、提高病虫害防控水平、减少农药施用、提升茄果类蔬菜产量及品质的重要途径，因此加快选育优良适宜的番茄砧木育种材料迫在眉睫[10-11]。本研究通过广泛收集番茄种质资源，采用田间抗性鉴定方法在番茄青枯病高发病区进行自然筛选，筛选出20个高世代稳定的多抗番茄砧木自交系材料，可为选育适用于福建番茄生产的砧木材料提供有利支持。我们利用目前已发表的抗枯萎病(I-2)、抗青枯病(RRS-342)、抗烟草花叶病TMV(Tm-2a)、抗根结线虫(Mi-1)和抗叶霉病(Cf-9)的基因标记进行单株抗病性鉴定[9,12-13]，再对抗青枯病为主、兼抗其他土传病害的番茄砧木材料进行田间鉴定，获得了聚合多个青枯病抗性较强且稳定、兼抗其他多种常见病害的番茄砧木自交系材料，为选育适用于福建番茄砧木一代杂种多抗品种的培育创造了种质材料和理论参考。

1 材料与方法

试验地设在福州市蔬菜科学研究所科研基地，其部分区块由于多年连续种植茄科类作物，已成为番茄青枯病重灾区，不抗青枯病的番茄品种感病率达80%以上，甚至绝收，这为筛选抗青枯病的番茄砧木材料提供了理想的自然筛选场所。

1.1 番茄砧木材料来源

自2014年起福州市蔬菜科学研究所番茄课题组从国内外征集番茄品种材料100余份进行试种，对青枯病抗性较强且稳定、兼抗其他多种常见病害的品种材料进行自交繁育单株留种，到2019年共获得稳定抗病且符合作番茄砧木的育种材料20份，其特征及来源见表1。

表1 供试番茄砧木材料及来源

1.2 DNA提取与5个抗病基因的分子标记检测

摘取番茄植株嫩叶，参考改良的CTAB法提取基因组DNA[14-15]，检测 DNA 浓度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，再用灭菌dd H2O稀释至10 ng/μL，-20 ℃保存。

抗枯萎病基因分子标记检测使用的引物由东北农业大学番茄课题组徐薪惟设计开发[9]；抗青枯病基因分子标记检测使用的引物由浙江大学番茄课题组设计开发[12]；抗烟草花叶病毒、抗根结线虫、抗叶霉病基因分子标记检测使用的引物由华中农业大学番茄课题组孙亚林设计开发[16](表2)。所有引物订购自生工生物工程(上海)股份有限公司。采用2×Pro Taq 预混液(大连宝生物工程有限公司)TaKaRa的PCR反应体系(25 μL)：2×Pro Taq Master Mix 12.5 μL、正反向引物(1.0 μmol/L)各 0.5 μL、DNA 模板(300～500 ng/μL)1.0 μL，用Rnase free water 补足至25 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性 30 s；98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃最终延伸2 min，保存。PCR 产物在1%琼脂糖凝胶100～110 V电压下电泳30 min，在凝胶成像系统上显示结果。

表2 用于分子标记进行抗病性鉴定的引物序列

1.3 田间抗病性鉴定

于2019年10月，在福州市蔬菜科学研究所试验基地开展番茄病害抗性鉴定试验，按常规方法进行栽培管理。采用五点取样法调查20份番茄砧木自交系材料大田青枯病、烟草花叶病、南方根结线虫、叶霉病的发病情况，计算病情指数，每组设3次重复。由于福建地区自然环境的原因，枯萎病不易发病，故无法统计。

青枯病的发生程度参照白占兵等[17]制定的分级标准。0级：为无病症；1级：植株顶端少数枝叶萎蔫；2级：全株1/3的植株自上而下萎蔫，但早晚尚有恢复能力；3级：全株1/2的枝叶萎蔫，且无恢复能力；4级：全株枝叶萎蔫、枯死。青枯病：高抗(HR)，0≤DI≤20.0；抗病(R)，20.060.0。

TMV的发生程度参照朱明涛等[14]TMV群体抗性分级标准。0级：植株健康，无症状；1级：明脉，轻花叶；3级：心叶及中部叶片花叶；5级：心叶及中部叶片花叶，个别叶片畸形、皱缩，植株轻度矮化；7级：重花叶，大量叶片畸形、皱缩或植株矮化；9级：重花叶，畸形，植株矮化严重或死亡。病情指数=0为免疫；0<病情指数<2为高抗(HR)；2<病情指数<15为抗病(R)；15<病情指数<30为耐病(MR)；病情指数>30为感病(S)。

南方根结线虫的发生程度参照毛爱军等[18]的分级标准。0级：植株根部完全健康；1级：植株根部有1至2个根瘤；2级：植株根部有3至10个根瘤；3级：植株根部有11至30个根瘤；4级：植株根部有31至100个根瘤；5级：植株根部根瘤数超过100个。南方根结线虫抗性分级：免疫(I)，DI=0；高抗(HR)，050.0。

叶霉病的发生程度参照冯壮志[13]的分级标准。0级：无症状；1级：叶片出现褪绿至黄色病斑；3级：叶片病斑上产生少量白色菌丝，无孢子；5级：接种叶病斑上产生菌丝和孢子；7级：接种病斑上产生大量孢子，并且菌丝发展到上部叶，但无孢子；9级：接种叶病斑上生有大量孢子。病情指数=0为免疫；0<病情指数<5为高抗；5<病情指数<15为抗病(R)；15<病情指数<30为耐病(MR)；病情指数>30为感病(S)。

计算公式：病情指数(DI)=Σ(各级病株数×相应级数)/(调查总株数×最高级数)×100。

2 结果与分析

2.1 番茄砧木材料分子标记抗性鉴定结果

含抗枯萎病I-2基因的番茄砧木材料能扩增出约1188 bp目的片段，如图1、表3所示，在Y-7-1、ZM48-2-1-3等13份材料中含有I-2基因，而另外7份材料则无。

表3 20份番茄砧木抗性基因检测结果

含抗青枯病RRS-342基因的番茄砧木能扩增出约342 bp目的片段，如图1、表3所示，Y-7-1、ZM48-2-1-3等10个材料含有RRS-342基因，而另外10份材料则无。

含有抗烟草花叶病Tm-2a基因的番茄砧木材料能扩增出约472 bp目的片段，而不含Tm-2a基因的材料则无扩增带，如图1、表3所示，供检测的20份番茄砧木材料全部含有Tm-2a基因。

含抗根结线虫Mi-1基因的番茄砧木材料能扩增出大约556 bp目的片段，如图1、表3所示，Y-7-1、Y-13-3-2等5个番茄砧木材料可以扩增出大小为556 bp 的条带，说明这5份番茄砧木材料含有Mi-1基因，另外15份材料则无。

含抗叶霉病Cf-9基因的番茄砧木材料能扩增出大约514 bp的片段，不含Cf-9基因的材料则无扩增带，如图1、表3所示，在Y-7-1、ZM16-1-E等13个番茄砧木材料中含有Cf-9基因，另外7份材料则无。

2.2 番茄砧木育种材料田间抗性鉴定结果

大部分番茄砧木材料对南方根结线虫、叶霉病，尤其是青枯病的田间抗性都达到了高抗或免疫水平，对烟草花叶病毒的抗性也达到抗以上水平(表4)， 这说明经过多年的田间自然环境选择是有效的。

表4 20份番茄砧木材料田间抗性鉴定结果

Y-7-1、ZM48-2-1-3、ZM36-3-6-1、ZM61-1-2-1这4种材料的青枯病的病情指数为0，且均检测到含有抗青枯病基因标记；ZM16-1-E、ZM5-1-1-3、ZM22-1-10、ZM22-1-7-12共4个材料的南方根结线虫病情指数为0，其中ZM22-1-10和ZM22-1-7-12检测到含有抗根结线虫基因标记；Y-7-1、ZM5-1-1-3、ZM36-3-6-1这3种材料的叶霉病情指数为0，Y-7-1和ZM36-3-6-1检测到含有抗叶霉病基因标记。Y-7-1、ZM22-1-10的青枯病、烟草花叶病毒、根结线虫、叶霉病病情指数均达到抗以上水平，且均检测到对应的抗病基因标记，由此表明这2个番茄材料是聚合多抗基因的番茄砧木。

3 讨论

华南地区受高温高湿气候条件的影响，番茄病害尤其是青枯病发生极为普遍，造成严重的减产绝收，严重制约了番茄产业的发展；优质品种抗病害种类单一且施用药剂效果有限[4，18]。较为有效安全的防治方法是选用高抗番茄青枯病的材料作砧木进行嫁接种植，这对提高番茄产量及保障农产品安全生产可以起到很大的作用[19-21]。

本研究对收集的番茄品种材料经6代以上自交获得稳定的20份番茄砧木材料进行了田间鉴定，结合分子标记技术对抗枯萎病、青枯病、烟草花叶病、根结线虫和叶霉病共5种抗性基因进行检测。结果表明，参试的20 份番茄砧木材料对枯萎病、青枯病、南方根结线虫等抗性都达到了抗、高抗或免疫水平，说明经过多年的田间自然环境选择是有效的。其中，Y-7-1、ZM48-2-1-3、ZM36-3-6-1、ZM61-1-2-1这4种材料青枯病的病情指数为0，且均检测到含有抗青枯病基因标记；ZM16-1-E、ZM5-1-1-3、ZM22-1-10、ZM22-1-7-12 这4种材料的南方根结线虫病情指数为0，且ZM22-1-10和ZM22-1-7-12检测到含有抗根结线虫基因标记；Y-7-1、ZM5-1-1-3、ZM36-3-6-1这3种材料的叶霉病情指数为0，Y-7-1和ZM36-3-6-1检测到含有抗叶霉病基因标记。本研究的大多数田间抗病性鉴定结果与分子鉴定结果相对应，尤其是Y-7-1、ZM22-1-10的青枯病、烟草花叶病、根结线虫、叶霉病病情指数均达到抗病以上水平，且所有抗病基因均被检测得到，因此，这2个番茄材料是聚合多抗基因的番茄砧木，说明采用分子标记技术对抗病基因进行检测结合田间抗病性鉴定筛选出聚合多抗基因的番茄材料的方法是可行并且有效的，可为加速培育优质番茄砧木品种提供参考。ZM36-1-4-11能鉴定得到抗青枯病基因，但田间抗性鉴定只达到抗病标准。所有的番茄砧木材料都能鉴定得到抗烟草花叶病基因，但田间抗病性表现不一，猜测是由于作物的抗病性大多属于多基因控制的数量遗传性状，其抗性表达程度易受环境变化影响[22-25]。下一步应进行抗病番茄砧木组合配制并对番茄嫁接亲和性及共生性进行研究，对不同生理小种抗性的水平和持久性进行进一步验证；在利用分子标记辅助聚合抗病基因过程中，还要综合考虑如果形、果色、果实质量、品质等其他因素。综上所述，只利用传统的育种方法将多个抗性基因聚合在一起是相当困难的，本研究对多个抗性基因进行检测结合田间鉴定，获得2个聚合多抗番茄砧木，减少了选择的盲目性，为番茄砧木育种创造了好材料，缩短育种进程。