亚抑菌浓度抗菌药物对细菌生物膜影响的研究进展

李婧，温海楠，王晓辉，谢守军(承德医学院附属医院检验科，河北承德 067000)

细菌生物膜是细菌在生长过程中黏附于生物或非生物表面后，被细菌自身产生的胞外基质包裹而形成的细菌聚集膜样物。由于生物膜的屏障作用和不均质的特点，抗菌药物很难杀死生物膜深部的细菌并会对其产生耐药选择作用，因此，当细菌以生物膜的形式存在时，细菌的耐药性会增强，抗菌药物不能有效抑制细菌生长和(或)杀灭细菌，导致患者出现感染迁延不愈和反复感染等情况[1]。近年来已有报道显示抗菌药物在亚抑菌浓度下会对细菌的生物膜产生影响[2]。鉴于其良好的临床应用前景，亚抑菌浓度抗菌药物对细菌生物膜的作用备受关注。

1 亚抑菌浓度(subinhibitory concentration，sub-MIC)的来源和意义

亚抑菌浓度是指低于最低抑菌浓度(MIC)的药物浓度水平。亚抑菌浓度抗菌药物广泛存在于自然界中，应用过抗菌药物的人和动物的排泄产物以及医疗废物的排放等都是产生亚抑菌浓度抗菌剂的常见途径[3]。近年来，由于抗菌药物的滥用，多重耐药、泛耐药甚至全耐药的菌株日益增多，因此常规治疗药物在暴露于这些细菌时，多处于不能杀灭病原菌的亚抑菌浓度水平。而即便是敏感的药物，在达到治疗浓度前也同样难免存在亚抑菌浓度阶段。在体内，亚抑菌浓度的抗菌药物可以上调细菌的突变率和基因转移率，影响生物被膜、细菌群体感应和毒力等，对细菌的生理结构具有潜在影响。

2 亚抑菌浓度抗菌药物对细菌生物膜形成的影响

亚抑菌浓度的抗菌药物既可以诱导细菌生物膜形成，又可以抑制其生物膜形成。相同抗菌药物对不同细菌生物膜的影响不同，不同的抗菌药物对同一细菌生物膜的影响也有所不同(见表1)。由于亚抑菌浓度在治疗感染过程中不可避免，因此研究亚抑菌浓度抗菌药物对细菌生物膜形成的调控，具有重要的临床意义。

表1 亚抑菌浓度抗菌药物对细菌生物膜的作用

2.1鲍曼不动杆菌 鲍曼不动杆菌是一种需氧的革兰阴性条件致病菌，广泛存在于自然界中，具有较强的获得和传播耐药性的能力。鲍曼不动杆菌常引起医院获得性肺炎，以及血流、腹腔、中枢神经系统、泌尿系统、皮肤软组织等感染，目

前已成为我国院内感染的主要致病菌之一。亚抑菌浓度抗菌药物对鲍曼不动杆菌生物膜形成的影响与多种因素有关，主要包括菌毛合成调控系统、群体感应系统(quorum-sensing system，QS)、生物膜相关蛋白(Bap)及外膜蛋白等[1]。近年来，随着了解深入，外排泵也被发现是影响鲍曼不动杆菌生物膜形成的一个重要因素。Chen等[23]对亚抑菌浓度替加环素研究发现，该药物对鲍曼不动杆菌生物膜的抑制作用很可能是外排泵基因的下调所致，特别是AdeFGH外排泵的下调。Navidifar等[4]将鲍曼不动杆菌暴露于亚抑菌浓度的美罗培南和替加环素后，发现除了生物膜形成基因、菌毛调控基因和群体感应基因外，编码外排泵基因的mRNA水平与生物膜形成能力也呈现显著的正相关。因此，外排泵的发现为临床治疗膜性鲍曼不动杆菌的感染提供了新的研究方向。

国内研究发现，亚抑菌浓度的亚胺培南对耐药和敏感的鲍曼不动杆菌生物膜的形成具有完全不同的作用[7]，这可能由实验条件和菌株差异所引起，但也同样提示，亚抑菌浓度抗菌药物对于不同敏感性菌株生物膜的影响也许还存在着更为复杂的调节机制。

2.2铜绿假单胞菌 铜绿假单胞菌是临床常见的非发酵革兰阴性杆菌，具有易定植、易变异和多耐药的特点，是引起下呼吸道感染的常见病原体，亦是引起烧伤感染的主要细菌。铜绿假单胞菌引起的感染性疾病，往往因为生物膜的形成而造成疾病的反复感染和难以治愈。对于膜性铜绿假单胞菌的治疗，亚抑菌浓度的抗菌药物可以通过下调毒力因子和影响细菌QS系统，甚至于联合用药的方式来抑制其生物膜的形成[24-25]。有研究发现，亚抑菌浓度的姜黄素与庆大霉素和阿奇霉素联用，可以通过对铜绿假单胞菌QS的抑制产生协同效果，从而进一步抑制其生物膜的形成[26]。这种联合用药的有效性为临床治疗生物膜感染提供了新的思路。

随着抗菌药物的广泛使用，泛耐药甚至全耐药的铜绿假单胞菌日益增多。对于泛耐药铜绿假单胞菌引起的下呼吸道感染，临床常采用氨基糖苷类联合用药的方式进行治疗[27]。有研究表明，氨基糖苷类药物在其亚抑菌浓度下均表现出明显的生物膜抑制作用，且碱性的培养环境(pH 7.9)对氨基糖苷类药物的抗生物膜活性具有支持作用[28-29]。铜绿假单胞菌生物膜的建立和毒力特性主要受以下2种QS细胞间通信系统的调控:las和rhl系统[8]。而亚抑菌浓度的氨基糖苷可有效阻断该菌QS系统的表达，并与QS调节蛋白LasR具有较强的结合力，这可能是该类药物抑制铜绿假单胞菌生物膜及毒力的一个重要靶点[29]。

2.3大肠埃希菌 大肠埃希菌是医院获得性及社区获得性感染中常见的革兰阴性菌，易引起泌尿系统的感染，其临床检出率占各种病原菌的首位，也是生物膜感染的重要病原菌。形成生物膜的大肠埃希菌具有高度的耐药性并能有效逃避免疫系统的攻击，使其感染易慢性化并难于控制。

环丙沙星是合成的第三代喹诺酮类药物，具有广谱抗菌活性，是泌尿系统感染的常用药物。有研究发现亚抑菌浓度的环丙沙星可以有效抑制大肠埃希菌生物膜的形成[13]。此外，Dong等[30]还发现亚抑菌浓度的环丙沙星可以通过抑制pgaABCD基因的表达，减少细胞外多糖释放，从而抑制生物膜的形成；同时，该药物还抑制了铁、fim和usp等毒力基因的表达，结果提示环丙沙星可能是一种较好的治疗生物膜相关感染的药物。但国外学者Lee等[14]却发现亚抑菌浓度的环丙沙星会增强大肠埃希菌SOS依赖毒力因子的表达和生物膜形成，并对2个小鼠大肠埃希菌UTI89感染模型进行了亚抑菌浓度环丙沙星的治疗，维持慢性感染状态的小鼠会产生预后不良，自然痊愈的小鼠在该种治疗下临床复发率也显著增加。Rafaque等[31]同样也发现，亚抑菌浓度的环丙沙星会显著诱导大肠埃希菌生物膜的形成，导致此种差异的原因尚不清楚，具体机制还有待进一步的讨论研究。

2.4肺炎克雷伯菌 肺炎克雷伯菌是一种革兰阴性菌，常引起泌尿系统、呼吸系统以及血流等感染。该菌具有丰富的荚膜，并依靠荚膜多糖和细菌分泌的黏附分子极易在物体表面形成生物膜结构，引起医院感染的暴发[32]。

碳青霉烯类药物是临床上常规应用于治疗革兰阴性菌的抗菌药物，具有广谱的抗菌性，但单独使用时对生物膜却没有很好的抑制和破坏作用。因此，国内学者穆小萍等[32]将不同抑菌浓度的阿奇霉素和亚胺培南联合作用于肺炎克雷伯菌，发现在特定亚抑菌浓度的2种抗菌药物作用下，临床分离的肺炎克雷伯菌生物膜受到明显抑制，相对应的luxS基因的表达也出现下调的现象。而luxS是细菌QS中AI-2产生所必需的基因，该基因的表达在肺炎克雷伯菌生物膜形成的早期具有重要作用。此外，刘五高等[33]还发现1/2 MIC的非抗菌药物茶多酚与临床常用抗菌药物亚胺培南、头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦等联用时，产生了良好的协同作用，明显降低了这些抗菌药物的耐药性，并显著抑制了多重耐药肺炎克雷伯菌生物膜和胞外黏液样物质的产生。亚抑菌浓度药物体外实验展现出的治疗效果为临床应用提供了良好的理论依据。

2.5金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌为临床常见病原菌，能产生多种毒素、酶及蛋白质抗原，可引起皮肤软组织感染、血流感染及全身各脏器感染，具有较强的致病力。有流行病学统计发现，软组织感染创面分离出的金黄色葡萄球菌大多都具有形成生物膜的特性,尤其是在糖尿病患者创面内分离的菌株，这提示金黄色葡萄球菌生物膜的形成与感染慢性化及再发关系密切[34]。

莫匹罗星是用于治疗革兰阳性球菌引起的皮肤感染的常用药物，具有很强的抗菌活性，即使对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)的感染也有疗效。然而，国外学者研究发现,亚抑菌浓度的莫匹罗星对MRSA生物膜的形成具有诱导作用，并发现与金黄色葡萄球菌生物膜形成相关的QS系统的细胞内效应物RNAⅢ存在表达上调的现象[17]。该结果也为莫匹罗星的应用提供了新的思路。

此外，国内外尚有其他亚抑菌浓度抗菌药物对金黄色葡萄球菌生物膜影响的相关报道。国内学者邢明勋等[18]发现亚抑菌浓度的阿奇霉素可有效抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，并呈剂量依赖式地抑制其溶血素和肠毒素A的分泌，1/2 MIC时其分泌几乎完全受到抑制。国外学者Jo等[19]通过研究暴露于亚抑菌浓度的左氧氟沙星和苯唑西林下的金黄色葡萄球菌，发现不同耐药谱的该菌在内酰胺酶活性、外排泵活性、生物膜形成能力和基因表达模式等方面表现出不同的表型和基因型特性。其对β-内酰胺酶和外排泵系统活性的差异，导致耐抗菌药物的金黄色葡萄球菌能在不同种类的抗菌药物之间获得交叉耐药性。该研究表明，监测抗菌药物敏感性模式对于有效治疗持续抗菌药物暴露情况下的耐药金黄色葡萄球菌感染至关重要。

2.6肠球菌 肠球菌是人类和动物肠道菌群和口腔中天然存在的一种条件致病菌。根据2018年中国CHINET细菌耐药监测结果显示，肠球菌在革兰阳性菌引起的医院感染中排第二位，仅次于金黄色葡萄球菌[35]。近年来，在许多肠球菌引起的感染中均观察到生物膜的存在，生物膜相关的肠球菌感染不仅难以根除，而且还成为细菌进一步传播的源头和耐药基因的储备库。

临床常见的肠球菌主要为粪肠球菌和屎肠球菌。通过统计分析发现，粪肠球菌似乎比屎肠球菌更容易形成生物膜[36]，这一特性增加了粪肠球菌治疗的困难度。研究发现，肠球菌生物膜的形成依赖于多种因素，如hyl、esp、gle和cyl等基因的表达[37]。Yuksel等[20]通过对临床常用抗菌药物的研究，发现亚抑菌浓度的红霉素、万古霉素和链霉素都可抑制肠球菌生物膜的形成，且细胞壁相关蛋白Esp可能是这几种药物调控肠球菌生物膜形成的重要靶点。由于肠球菌是根管治疗后引起慢性牙周炎的常见病原菌，因此，也有学者通过对亚抑菌浓度根管治疗药物的研究，发现粪肠球菌分离株在形成生物膜的能力上表现出显著的克隆变异现象，且其黏液的产生与分离菌形成生物膜的能力之间存在密切相关性[21]，提示粪肠球菌在根管治疗药物作用下形成生物膜的分离株可能具有更强的存活能力。

3 结论

抗菌药物在亚抑菌浓度下可以改变细菌生物膜的形成，且对细菌的耐药性和致病性都存在不同程度的影响。目前对于亚抑菌浓度抗菌药物对生物膜影响的相关研究，大多样本量较小，这可能与其实验步骤的繁杂程度有关，但也难免会造成抽样误差的增加，使结果的可靠性下降。因此，很多抗菌药物对菌株生物膜的影响还存在争议，有待进一步的研究考证。

亚抑菌浓度抗菌药物对细菌生物膜的调节是一个多因素参与的复杂过程，虽然与之相关的报道很多，但大多未阐明其具体机制。通过对上述常见病原体的研究发现，细菌的QS系统被认为是调节生物膜的关键因素，与生物膜的形成、细菌的耐药性和致病性都密切相关。除此之外，菌毛调控系统、外排泵和外膜蛋白等也都被发现可能是亚抑菌浓度抗菌药物对细菌生物膜调控的因素，不同的亚抑菌浓度抗菌药物作用于不同的细菌时会针对其相应的靶点而对其生物膜产生不同程度的影响。由于其繁多的调节位点和复杂的调节机制，现今还无法将常用抗菌药物对常见病原菌的作用靶点一一对应。因此，对于亚抑菌浓度抗菌药物对细菌生物膜影响及相关机制的研究还任重而道远。