无精子症患者Y染色体序列标签位点-聚合酶链反应与二代测序检测的比较*

张帆，刘永杰，代良(银川市妇幼保健院生殖医学中心，银川 750001)

人群中约有15%的夫妇受不孕不育影响，男女因素各占一半[1]，男方因素除了少弱畸形精子症外，无精子症甚至占到10%。导致无精子症发生的因素有很多，遗传因素所致的非梗阻性无精子症尤为复杂，Y染色体微缺失是仅次于克氏征(klinefelter syndrome)导致睾丸生精障碍的第二大遗传因素[2]，患病率为2%～10%[3]。采用序列标签位点-聚合酶链反应(STS-PCR)检测Y染色体无精子因子(azoospermia factor，AZF)的微缺失是临床上男科医生判断无精子症病因以及决策后续治疗手段的重要实验室依据[4]，检测方法较为成熟，结果可靠。目前采用高通量DNA测序技术——二代测序(next generation sequencing，NGS)检测100 kb以上基因组拷贝数变异(copy number variation，CNVs)的出现为无精子症遗传因素的探讨打开了新的思路，但检测结果的准确性有待商榷。为此，我们收集了133例无精子症患者，针对Y染色体分别用STS-PCR检测AZF、NGS检测CNVs，并分析比较2种检测方法的结果。

1 资料与方法

1.1研究对象 收集2018年10月至2020年10月就诊于银川市妇幼保健院生殖医学中心的非梗阻性无精子症患者133例，年龄23～45岁。排除梗阻性无精子症、隐睾、精索静脉曲张、睾丸损伤等因素所致的无精子症。所有参与本研究的患者均签署知情同意书，且本研究获得我院医学伦理委员会批准(批准文号：2021012)。

1.2主要仪器与试剂 基因扩增仪(美国Thermo Fisher公司)，YN sep100全自动单通道毛细管电泳仪(亚能生物技术有限公司)，NextSeq CN500基因测序仪(美国Illumina公司)。核酸提取试剂盒(德国QIAGEN公司)，Y染色体微缺失基因检测试剂盒(亚能生物技术公司)，染色体拷贝数变异检测试剂盒(杭州贝瑞和康基因诊断技术公司)。

1.3STS-PCR检测Y染色体AZF微缺失 《欧洲Y染色体微缺失分子诊断指南》[5]推荐的检测AZF微缺失包括6个STS，本研究经改良STS-PCR检测体系，扩增为15个STS，包括AZFa区的sY84/sY86、AZFb区的sY124/sY127/sY128/sY133/sY134/sY143/sY1192、AZFc区的sY152/sY239/sY242/sY254/sY255以及AZFb/c区的sY145。根据各STS基因序列特点，设计高度特异的引物，检测人类男性Y染色体性别决定基因(sex-determining region of Y-chromosome，SRY)作为性别异常对照以及人类锌指蛋白基因ZFX/Y作为实验内控。对研究对象的外周抗凝全血标本依次进行DNA提取、PCR扩增、毛细管电泳检测等步骤，最终分析判读电泳结果。由宁夏金域医学检验所(有限公司)完成检测。

1.4NGS检测Y染色体CNVs 从研究对象的外周抗凝全血标本中提取基因组DNA，取10 ng DNA采用“快速PCR-free文库构建技术”构建文库，打断DNA，修复酶切缺口和双链末端，磷酸化修饰并与引物连接后，用NextSeq CN500基因测序仪测序，用杭州贝瑞和康基因诊断技术公司的数据分析软件分析数据，仔细筛选出Y染色体的CNVs检测结果，该结果是综合参考人类基因组hg19版本、基因组变异数据库(DGV)、人类染色体不平衡和表型数据库(DECIPHER)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、加利福尼亚大学圣克鲁兹分校数据库(UCSC)及PubMed等公共数据库的最新公布数据而确定的。由北京贝瑞和康生物技术公司完成。

1.5统计学分析 所有资料均录入EXCEL表，计数资料采用率(%)表示。采用SPSS 17.0软件进行统计分析。用卡方检验分析2种检测方法的差异性，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1STS-PCR检测Y染色体AZF微缺失情况 检测15个STS位点时，133例无精子症患者中，Y染色体AZF微缺失异常17例(12.78%)，其中缺失14个STS 1例，占5.88%；缺失12个STS 3例，占17.65%；缺失11个STS 1例，占5.88%；缺失6个STS 1例，占5.88%；缺失5个STS 1例，占5.88%；缺失4个STS 2例，占11.76%；缺失2个STS 1例，占5.88%；缺失1个STS 7例，占41.18%。检测经典的6个STS(sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255)时[5]，133例无精子症患者中，Y染色体AZF微缺失异常10例(7.52%)，其中缺失6个STS 1例，占10%；缺失4个STS 4例，占40%；缺失2个STS 5例，占50%。见表1。

2.2NGS检测Y染色体CNVs的情况 133例无精子症患者中，Y染色体CNVs异常12例(9.02%)，其中既重复又缺失3例，占25%；重复(dup)4例，占33.33%；缺失(del)5例，占41.67%。见表1。

2.3Y染色体AZF微缺失与CNVs缺失的比较 133例无精子症患者中，STS-PCR检测Y染色体AZF的15个STS微缺失的结果与NGS检测Y染色体CNVs缺失的结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2；STS-PCR检测Y染色体AZF的6个STS微缺失的结果与NGS检测Y染色体CNVs缺失的结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表2 Y染色体AZF(15个STS)微缺失与CNVs缺失的比较

表3 Y染色体AZF(6个STS)微缺失与CNVs缺失的比较

3 讨论

WHO《人类精液检查与处理实验室手册》第5版指出,精液连续3次离心后取沉淀,显微镜镜检未见精子即为无精子症[6]。根据精子发生及精道的畅通与否，可分为梗阻性无精子症(obstructive azoospermia，OA)与非梗阻性无精子症(nonobstructive azoospermia，NOA)。OA可以通过手术解除梗阻或通过睾丸精子抽吸术(testicular sperm aspiration，TESA)来获取精子，而NOA却办法甚少。导致NOA的因素多种多样，其中遗传因素是最为复杂的原因。Y染色体是人类仅有的单倍遗传的染色体[7]，作为男性性别决定基因的载体，包含许多与精子发生相关的基因。然而Y染色体特有的多拷贝基因、重复序列以及高度多态性等特点[8]，更容易导致男性不育。

1976年Tiepolo等[9]首次提出Y染色体长臂(Yq11)上存在与精子发生相关的基因，即AZF，其内密集排列着大量与生精相关的基因。近年来许多研究发现Y染色体AZF微缺失引起的睾丸生精障碍是导致男性不育的重要遗传因素，临床上表现为男性无精子症和严重少精子症[10]，其中，无精子症Y染色体AZF微缺失的发生率为10%～15%，严重少精子症Y染色体AZF微缺失的发生率为5%～10%。Vogt等[11]将Y染色体AZF划分为a、b、c 3个相互独立的区域，其中以AZFc区的缺失最多见，约占60%，AZFb区的缺失次之，AZFa区缺失最少见。我们的实验结果与其基本一致。AZFa区缺失的患者表现为唯支持细胞综合征(sertoli cell only syndrome，SCOS)，伴睾丸体积缩小，无精子生成。AZFb区缺失的患者会导致男性精子细胞成熟障碍，生精阻滞于减数分裂前期或减数分裂期，睾丸活检可见精原细胞和初级精母细胞，无精子生成[12]。AZFc区缺失最常见[13]，组织学表型及临床表现多样，其中约2/3的患者表现为无精子症。

值得一提的是，本研究中的133例无精子症患者中，有9例AZFb区(sY1192)缺失，检出率高达6.77%，且其中7例仅为sY1192单一缺失。但目前有关sY1192位点缺失的病例罕见报道，其引起生精阻滞的机制及意义有待进一步明确。在经典6个STS检测的基础之上是否需要增加该位点的检测值得进一步探索。

NGS技术通过检测100 kb以上基因组CNVs来分析Y染色体畸变情况。Zhu等[14]研究表明CNVs的大小与男性不育症相关。本研究发现，NGS检出的Y染色体CNVs重复(dup)是目前STS-PCR无法检出的。因此，我们推测基因重复也有可能导致无精子症。在检测基因缺失方面，STS-PCR检测Y染色体AZF微缺失与NGS检测Y染色体CNVs缺失(del)的一致性比较，目前尚无相关报道。有文献显示AZFc区的CNVs与男性生精障碍的风险增加相关[15]，但是关于二者检测基因缺失方面的意义尚不明确。本研究发现，Y染色体AZF(15个STS)微缺失的结果与CNVs缺失结果相比，差异有统计学意义(P<0.05)，而Y染色体AZF(经典6个STS)微缺失的结果与CNVs缺失结果相比，差异无统计学意义(P=0.357)。由于目前检测的是100 kb以上的CNVs，可能存在某些STS位点漏检的情况，尤其是新的STS如sY1192或小片段的缺失。如果未来技术允许检测更小的CNVs片段，对于探索Y染色体基因层面导致男性不育症将会有极大的价值。

综上所述，采用STS-PCR检测Y染色体AZF微缺失是无精子症的重要实验室遗传检测手段，但究竟检测多少个STS位点更合适，仍需探索。采用NGS检测Y染色体CNVs尚未被广泛应用，但本研究发现其在诊断无精子症的遗传依据方面，有其独特价值。因此，我们认为2种检测方法互有补充，通常情况下，对于无精子症患者，可以考虑采用NGS作为筛选，而采用STS-PCR作为验证。关于2种检测方法的价值与意义，有待进一步探讨。