电镜下黄连素液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株的抑制作用及超微结构的影响

胡致恺 叶姝 叶静静 陈宁刚

摘要：目的：通过黄连素液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株进行的体外抑菌试验，观察黄连素液的抑菌效果，并以电镜观察细菌超微结构的改变。方法：用医院自制的黄连素液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株进行处理后，用电镜观察细菌超微结构的改变。结果：电镜下，经黄连素液处理的耐药菌株菌体分散，部分菌体固缩死亡，而陰性对照组表现为细菌菌体聚集成团，表面光滑，细胞结构完整、胞质均匀，可见有丝分裂。结论：黄连素液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株有较强的抑菌效果。

关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;黄连素;透射电镜

本研究用黄连素液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株进行体外试验，并采取电镜来进一步监测细菌自身超微特征的变化情况，来观察黄连素液的抑菌效果，现报道如下：

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 黄连素液

5%黄连素液为医院长期临床使用的院内制剂，250  g黄连中药药材粉碎加水浸泡2 h，强火加热至沸，再以文火煎煮至5 000 ml原液，即0.05 g/ml的中药原液，高压灭菌后置4℃冰箱保存备用，保质期1个月。

1.1.2 试验菌株

分离自医院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染患者的伤口分泌物，经Vitek-2 Compact（购自BIOMERIELIX公司）鉴定并经平板生长观察证实为产生物膜的MRSA菌株。将保存的试验菌株接种于5%血平板，置37℃（ gSP‐9270MBE 隔水式恒温培养箱，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂）培养24 h，连续转种培养3次。选定质控菌株ST-239，-80℃冰箱中保存备用。

1.2 研究方法

1.2.1 菌悬液制备

菌种复苏，挑取菌落至3%胰蛋白胨大豆肉汤（Trypticase Soybroth， TBS）液体培养基中，1 30 r/min，37℃匀速振荡培养过夜，再以1：100比例重新接种至新的TBS中，1 30 r/min，37℃匀速振荡培养195 min至对数生长期。取菌液离心，6 000 r/min，15 min，用无菌PBS冲洗两遍，然后混悬至×109 CFU/ml。

1.2.2 电镜样品制备

取约1×107 ml的菌悬液涂布于0.05 g/ml黄连素液的平板表面，置于37℃培养24 h后收集平板上的菌体。用PBS洗涤菌体沉淀3次后，将得到的菌体滴到载玻片上，制成菌悬液涂片。放入电镜扫描使用的2.5%戊二醛磷酸缓冲液中保持稳定3 h;0.1M PBS缓冲液冲洗2次，每次时限为15 min;加入1%锇酸后固定1 h;0.1M PBS冲洗15min×2次;2%醋酸铀水溶液染色30 min;50%、70%、90%酒精依次脱水，各15 min×1次;100%酒精脱水20 min×1次;100%丙酮脱水20 min×2次;1：1渗透：无水丙酮与包埋剂按1：1体积混合渗透菌体，并震荡2 h;纯包埋剂渗透菌体，并震荡2 h;纯包埋剂包埋，并置于烘箱内聚合，37℃聚合24 h，45℃聚合24 h，60℃聚合48 h;染色：4%醋酸铀染色20 min，枸橼酸铅染色5 min;将染色后的涂片拍照要求以单孔铜网进行固定，利用电镜透射进行拍照观察和记录。对照组进行空白的菌体，操作步骤相似，可参照实现。

2结果

两组MRSA菌株在电镜下的形态    空白菌体对照组（不加黄连素液的菌悬液）MRSA菌株菌体透亮，无固缩，聚集成团，偶见正在分裂的菌体。加黄连素液的菌悬液MRSA菌株菌体固缩，不成团。

3讨论

黄连作为多年生草本植物，主要来源有三种，分别是毛莨科植物黄连、三角叶黄连或云连，取上述三种中药晒干得根茎即可，主要成份以小蘖碱为主（超过3.6%）[1～2]。黄连在中药领域以清热燥湿、泻火解毒为主，但是该药的抗菌谱也较广，可以对多种细菌产生敏感抗菌作用[3～4]，如金黄色葡萄球菌等，研究发现对至少高达9种以上的真菌有效果。本研究结果显示，在形态学上正常的MRSA菌株菌体透亮，无固缩，聚集成团，偶见正在分裂的菌体，增殖活跃;而经黄连素液作用后MRSA菌株形态学上发生明显改变，出现菌体固缩，不成团，增殖明显受到抑制，并出现菌体死亡。从而证实：黄连素液确实对MRSA具有抑制作用。

通过电镜观察得出黄连素对MRSA有较好的抑菌作用，但具体在何环节发挥药理作用及其具体的抑菌作用情况尚未确定，需要深入探讨，提升中草药抑菌的现代病理学理论研究水平。

参考文献

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：人民卫生出版社，化学工业出版社，1990.275-276.

[2]王维琪.黄连有效成分的药理研究与进展[J].中医临床研究，2016，8（26）：147-148.

[3]姚冬婷，胡骏，张雪清，等.黄连对金黄色葡萄球菌体外抑菌活性的分析[J].检验医学，2017，32（7）：577-581.

[4]谢川东，文燕，曾昱伟，等.黄连抗菌活性成分研究[J].湖北农业科学，2018，57（23）：85-88.