热激联合牛蒡抗热保护剂对益生菌奶粉中益生菌喷雾干燥活性的影响

崔莉 李莹 冯进 柴智

摘要：提高益生菌抗热性的研究一直是工业化喷雾干燥生产益生菌奶粉的热点与难点，研究益生菌 FM-LP-4 的热激预处理条件，优化菌体经热激预处理后使用牛蒡复合抗热保护剂的喷雾干燥工艺。结果表明，适宜进行热激的益生菌培养时间段为10～11 h，最适热激温度为55 ℃，热激时间为25 min。喷雾干燥的最优工艺为：出口温度80 ℃，进口温度170 ℃，进料速率0.8 L/h，此时活菌数为4.64×109 CFU/mL。热激菌体加牛蒡复合抗热保护剂经优化的喷雾干燥工艺获得益生菌奶粉，其中益生菌活菌数比对照提高约1个数量级。

关键词：牛蒡;益生菌;热激;喷雾干燥;奶粉

中图分类号：TS252.51  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）10-0166-04

中国已经赶超日本、美国成为全球第一大奶粉消费国。随着人们营养保健意识的不断提高和消费观念的转变，具有营养保健功能的高端乳制品日益成为新的消费引擎。益生菌奶粉为含有益生菌的奶粉，具有改善人体肠道宿主环境的作用。目前，我国市场上高档的功能性益生菌乳制品已出现，然而，大多以发酵乳的形式出现，需冷链运输，且保质期短。功能性益生菌奶粉的研制，突破了运输壁垒，扩大消费区域，具有广阔的市场化前景。

益生菌奶粉常采用将奶粉和冻干益生菌粉混合的方法制备，冷冻干燥的高成本是其瓶颈。若能采用喷雾干燥1次制备益生菌奶粉，则有望大幅降低成本。喷雾干燥过程对益生菌带来脱水、氧化和热损伤，造成活菌数大量下降。有学者提出，多种方法来提升喷雾干燥益生菌的活性，主要有加强对细胞结构的保护、提升益生菌的外界应激抗性，优化喷雾干燥参数，筛选应用抗热保护剂等[1]。益生菌在外界应激下会生成应激蛋白用于修复受损细胞，提升菌体应激抗性。热激处理是利用上述特性，通过模拟外界应激条件以增加菌体对应激环境的耐受能力，是一种较常用的提升菌体耐热能力的途径。

喷雾干燥抗热保护剂的筛选已成为相关学者关注热点，合适的保护剂能有效提高益生菌在干燥、储藏和体内消化过程等严苛环境下的存活率。Chaikham等研究发现，益生元（菊糖、木糖和低聚果糖等）对益生菌的耐热性有保护作用[2]。牛蒡块根富含菊糖、酚酸、黄酮、牛蒡苷及多种维生素等营养功能成分。现代医学证明，牛蒡具有抗氧化、抑菌、抗疲劳、免疫调节、保护肝脏[2-3]、促进益生菌生长等多种功效[4-5]。雷张腾将菊糖作为保拉迪酵母的复合冻干保护剂成分，并认为菊糖中的羟基通过与细胞膜磷脂和蛋白质以氢键结合，对菌体起到保护作用[6]。崔莉等通过单因素和正交设计优化获得FM-LP-4牛蒡复合抗热保护剂配方（丰县牛蒡粉2.0%、葡萄糖4%、沛县牛蒡粉2.0%），菌体在复合保护剂保护下经75 ℃热处理10 min后活菌数为2.12×106 CFU/mL[7]。本研究在获得保护剂配方的基础上，探讨热激处理和喷雾干燥工艺参数优化对益生菌奶粉中益生菌FM-LP-4的耐热保护作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

副干酪乳杆菌FM-LP-4为研究室保藏。试验时间为2019年7月12日至8月17日。明胶，用PBS溶解后灭菌备用，使用前水浴加热溶解。蔗糖和甘油：需经微孔滤膜过滤。陆桥MRS肉汤培养基。MRS固体培养基，在液体培养基的基础上加入1.5%琼脂。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-ID 型净化工作台，苏州净化设备有限公司;上海第三分析仪器厂;高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂;H1850R型高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司;HH-4 数显恒温水浴锅，国华电器有限公司;HYG-A全温摇瓶柜，太仓实验设备厂;FW100高速万能打粉机，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化及扩大培养 将副干酪乳杆菌 FM-LP-4 冻干菌种接入液体培养基中，34 ℃振荡培养24 h，活化2～3次。活化好的种子液以5%的接种量接种于MRS 液体培养基中，同样条件扩大培养后菌液离心取菌泥，用无菌生理盐水或牛奶冲洗，制成活菌数为1010 CFU/mL的菌悬液。

1.3.2 活菌数测定 按照GB 4789.35—2010，采用稀释涂布平板计数法。

1.3.3 牛蒡复合抗热保护剂的制备 牛蒡超微粉的制备：将丰县和沛县牛蒡于60 ℃下干燥4 h，至水分6%以下，经粉碎机超低温粉碎，过325目筛得牛蒡超微粉。牛蒡复合抗热保护剂配方为丰县牛蒡粉2.0%、葡萄糖4%、沛县牛蒡粉2.0%。

1.3.4 抗氧化能力的測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的测定 参考Shen 等的方法[8]，略做改进。1 mL经热激预处理菌液溶解到9 mL 95% 乙醇溶液，取2 mL样品混合溶液加 2 mL 0.16 mmol/L DPPH 溶液，25 ℃ 水浴加热 0 min，在517 nm处测试样吸光度（Di），用蒸馏水代替上述体系中样品混合溶液测得空白吸光度（D0），用 95% 乙醇代替上述体系中 DPPH 溶液。测得样品本底吸光度（Dj），清除率=1-（Di-Dj）/D0×100%，其中D0取0.552。

1.3.4.2 OH自由基清除能力的测定 参考Shen等的方法[8]，略做改进。1 mL经热激预处理菌液溶解到9 mL 95%乙醇溶液，取4 mL样品混合溶液加入8.8 mmol/L H2O2、9 mmol/L FeSO4 和 9 mmol/L水杨酸各 0.5 mL，混匀，37 ℃水浴加热30 min，在 510 nm 处测定吸光度（Di′），用蒸馏水代替体系中样品混合溶液，测得空白吸光度（D0′），用蒸馏水替代HO溶液，测得样品本底吸光度（Dj′），清除率=1-（Di′-Dj′）/D0′×100%，其中D0′取0.602。

1.3.4.3 Fe3+还原力的测定[9] 1 mL经热激预处理菌液溶解到9 mL 95% 乙醇溶液。取2 mL样品混合溶液加入10 g/L铁氰化钾溶液和 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH值6.6）各2 mL，于50 ℃ 保温 20 min，加入2 mL 1 g/mL 三氯乙酸溶液，混匀，3 000 r/min 離心10 min，取 2 mL 上清液，加入 2 mL 蒸馏水和 0.4 mL 1 g/L 三氯化铁溶液，室温反应10 min，于700 nm 处测定吸光度。

1.3.5 热激条件

1.3.5.1 热激菌体培养时间的选择 根据FM-LP-4生长曲线，选择对数期菌数较多的时间段作为热激菌体培养最佳时间段。

1.3.5.2 耐热曲线 选择45、50、55、60 ℃为热处理温度，将益生菌液在上述温度下水浴，每隔5 min测定活菌数，以热处理时间为横坐标、活菌数为纵坐标绘制其耐热曲线。

1.3.5.3 不同热激条件对菌体抗氧化活性的影响 在选定的热激条件下对FM-LP-4热激处理，测定抗氧化活性变化，选择菌体抗氧化活性较高的热激条件。

1.3.6 喷雾干燥条件对益生菌奶粉中益生菌活菌数的测定的影响 经热激预处理菌液离心得菌泥，溶解于不同浓度含牛蒡复合抗热保护剂无菌牛奶中，采用正交试验L9（34）对出口温度（A）、进口温度（B）、进料速率（C）3项喷雾干燥工艺参数对益生菌奶粉中益生菌活菌数的测定的影响进行检测，正交试验因素水平见表1。试验结果采用SPSS 13.0统计软件进行分析，以筛选出最佳喷雾干燥条件。

1.3.7 数据统计分析 用Microsoft Excel 1997—2003进行数据整理和作图分析，采用SAS V8统计进行方差分析，并应用t检验进行样品间的显著性差异分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 FM-LP-4亚致死热激条件确定

2.1.1 最佳耐热时间的选择 从图1可以看出，10～12 h 的FM-LP-4生长速率最快，此时LA达到对数生长期，并在培养12 h的时候达到了菌数的最大值，Corcoran等认为，对数生长期的菌体较稳定生长期的菌体可塑性强，应对胁迫情况提升抗逆性好，可以很快调整体内代谢途径以适应不利环境[10-11]。张书猛等研究比较嗜酸乳杆菌在不同菌体生长期的耐热性，提出其在稳定期即培养11 h时，抗热性能较优[12]。结合相关研究，选择10～12 h 为热激菌体培养最佳时间段。

2.1.2 FM-LP-4耐热曲线 从图2可以看出，FM-LP-4在60 ℃条件下处理15 min基本失活。在45、50、55 ℃条件下，处理25 min时，菌数均有较明显的下降，但依然保持较好的存活率。胡榴榴研究发现，干酪乳杆菌1.12.8 在50 ℃热处理25 min后，活菌数下降不到1个数量级;60 ℃热处理 25 min，菌体数量下降了约1个数量级[13]，因此确定60 ℃ 25 min 为其热激处理条件。

L. plantarum 299v在喷雾干燥前经过49.5 ℃的亚致死温度处理30、60 min于室温下贮藏180 d，其存活性显著增强，并推测热应激引起的保护作用有可能是生成了热休克蛋白[14]。L.acidophilus以 50 ℃、L. rhamnosus以 52.5 ℃亚致死预处理12 min后，均能够耐受随后的92 ℃的喷雾干燥出口温度，而通常乳酸菌能够耐受的温度为 85～90 ℃[15]。经过亚致死温度（52 ℃，15 min）预处理后再喷雾干燥将使L. casei Nad、L. plantarum 8329的菌数下降0.16、0.49 lg（CFU/mL），而未经预处理直接喷雾干燥其菌数下降0.85、0.95 lg（CFU/mL）[16]。

2.1.3 不同热激温度对抗氧化活性的影响 从表2可以看出，FM-LP-4在55 ℃条件下处理25 min时，各项抗氧化指标均高于50 ℃。张书猛等选取40、45、50、55、60 ℃进行30 min热激处理，研究其热激后的菌数变化，发现在45 ℃时菌体具有较高的活菌数，存活率也较高，并且具有较好的发酵性能[12]，所以选择45 ℃作为热激温度。从图2、表2可以看出，FM-LP-4在55 ℃条件下的存活率较高，而且抗氧化活性最高，推测其经热激休克后产生了热适应，故选择55 ℃处理25 min为最佳热激条件。

2.2 含FM-LP-4 奶粉的喷雾干燥工艺确定

2.2.1 喷雾干燥正交试验 含FM-LP-4 奶粉的喷雾干燥工艺参数L9（34）正交试验因素水平取值及结果见表3。经直观分析比较3个因素的极差R值可知各因素对喷雾干燥后菌存活的影响程度为A>B>C，由各因素的均值大小可知最佳组合为A1B3C3，即喷雾干燥工艺参数为：出口温度 80 ℃，进口温度170 ℃，进料速率0.8 L/h。

2.3 热激、牛蒡复合抗热保护剂和喷雾干燥工艺优化及联合对益生菌抗热性能的影响

从表4可知，牛蒡复合抗热保护剂可以提升益生菌的存活率近2倍，热激联合牛蒡复合抗热保护剂则可以将益生菌的活菌数提高约1个数量级。

3 结论

FM-LP-4适宜进行热激的培养时间段为 10～11 h，最适热激温度为55 ℃，热激时间为 25 min。含FM-LP-4益生菌奶粉喷雾干燥的最优工艺为：出口温度80 ℃，进口温度170 ℃，进料速率0.8 L/h，热激联合牛蒡复合抗热保护处理益生菌经喷雾干燥后活菌数比对照提高约1个数量级。

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