陈 忱
北大荒完达山乳业股份有限公司质检中心,黑龙江哈尔滨 150000
维生素A又名视黄醇,化学式C20H30O。维生素A是一种必需营养元素[1],具有广泛的生理功能,包括参与视觉过程、细胞增殖和分化、细胞间信息交流、器官与组织的生长、生殖以及免疫系统功能[2,3]。目前,维生素A缺乏仍然是许多发展中国家所面临的一项重要的公共卫生问题,严重威胁着婴幼儿的生长发育[4]。
目前,关于母乳和牛乳中维生素A含量测定的方法最常用的是高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。相对于传统的比色法和苯并芘内标定量法,这两种方法都能更好的规避掉原有方法中分析法仪器配置复杂、灵活性差、分析时间太长,易造成维生素A回收率低的弊端。又由于超高效液相色谱-串联色谱法(HPLC-MS/MS)对于样品的前处理复杂,检测成本高,不利于广泛推广。因此,本文采用高效液相色谱法测定,此方法前处理简单、灵敏度高、易改进分离条件。
采用《GB 5009.82—2016食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定》(第一法食品中维生素A和维生素E的测定反向高效液相色谱法)进行牛乳及母乳在初乳期、过渡期和成熟期3个不同时期中维生素A的含量变化,并对数据进行比较分析,为婴幼儿配方乳粉母乳化提供相关技术参考。试样在前处理过程中先经皂化(含淀粉先用淀粉酶酶解)、提取、净化、浓缩后,再通过C18色谱柱反相液相色谱柱分离,紫外检测器检测,外标法定量。
1.1.1 仪器
高效液相色谱:赛默飞UltiMate 3000;水浴磁力恒温搅拌器:METTLER TOLEDO生产MP220;分液漏斗萃取净化振荡器;旋转蒸发仪;氮吹仪;涡旋混合器:IKA VORTEX生产,型号GENIUS 3。
1.1.2 维生素A标准品
维生素A(C20H30O,CAS号:68-26-8):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质;维生素A储备液:浓度1.0mg/mL;维生素A工作液:浓度分别为2.5000μg/mL、5.0000μg/mL、10.0000μg/mL、15.0000μg/mL、20.0000μg/mL、25.0000μg/mL。
超纯水:Millipore纯水机制备;甲醇:SK生产,色谱纯;石油醚:科密欧生产,优级纯;2,6-二叔丁基对甲酚(BHT):科密欧生产,优级纯。
1.3.1 母乳采集
《食品营养和检测》一书提到,维生素A含量在母乳中随着哺乳期时间变化而变化,根据人泌乳期分为初乳期(产后0~9天内)、过渡期(产后9~30天)、成熟期(2~5月)。母乳采样分为3组,每组进行10个不同样本测定[5]。
母乳的采集对象为产后0~12月健康产妇。以“知情自愿”为原则,乳母饮食均衡,奶水充足,无重大急慢性遗传传染病,无任何哺乳禁忌症[6]。
1.3.2 牛乳采集
选择来自北大荒完达山乳业股份有限公司天然有机牧场的10头处于初乳期(产后0~14天)的奶牛进行牛乳采集。
1.4.1 样品处理
处理过程应避免紫外光照,尽可能避光操作,提取过程应在通风柜中操作。
(1)皂化
称取50.00g(精确至0.01g)液体试样于150mL平底烧瓶中,固体试样需加入约20mL温水,混匀,再加入1.00g抗坏血酸和0.10gBHT,混匀,加入40mL无水乙醇,加入10mL氢氧化钾溶液,边加边振摇,混匀后于60℃恒温水浴震荡皂化45.000min,皂化后立即用冷水冷却至室温。
(2)提取
将皂化液用30mL水转入250mL的分液漏斗中,加入50mL石油醚,振荡萃取5.000min,将下层溶液转移至另一250mL的分液漏斗中,加入50mL的石油醚再次萃取,合并醚层。
(3)洗涤
用约100mL水洗涤醚层,约需重复3次,直至将醚层洗至中性(可用pH试纸检测下层溶液pH值),去除下层水相。
(4)浓缩
将洗涤后的醚层经无水硫酸钠(约3.00g)滤入250mL旋转蒸发瓶中,用约15mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次,并入蒸发瓶内,并将其接在旋转蒸发仪上,于40℃水浴中减压蒸馏浓缩,待瓶中醚液剩下约2mL时,取下蒸发瓶,立即用氮气吹至近干。用甲醇分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至10mL容量瓶中,定容至刻度。溶液过0.22μm有机系滤膜后供高效液相色谱测定维生素A。
1.4.2 分离条件(反相液相色谱条件)
色谱柱:C18柱(柱长250.0mm,内径4.6mm,粒径5μm);柱温:25℃;流动相:甲醇;流速:1mL/min;紫外检测波长:维生素A为325nm;进样量:10μL。
通过采用上述方法对样品和标准品进行处理,图谱见图1、2。可以看出维生素A标准品和样品出峰时间均为3.297min。通过对不同时期样品的谱图进行分析,发现维生素A在该保留时间与其他峰都得到较好的分离,该保留时间内没有检测到干扰峰,并验证了此方法的有效性。因此,可以确定母乳中维生素A目标峰的保留时间为3.297min。
图1 维生素A标准品图谱
图2 含维生素A母乳图谱
根据实验检测浓度的要求,测量范围应覆盖方法的最低浓度水平(定量限)和关注浓度水平,确定维生素A标准曲线浓度范围为0.0958μg/mL,0.1915μg/mL,0.3831μg/mL,0.7661μg/mL,1.5323μg/mL,1.9153μg/mL(浓度均经过分光光度计校正)测定标准曲线(规定曲线包含0点但不强制过0点),每一点浓度测定3次,使用3次数据拟合得到以下线性参数,各浓度点对应的浓度和峰面积见表1。
表1 维生素A标准溶液浓度与对应峰面积
最终得出维生素A的拟合标准曲线的线性方程为Y=1.4090X-0.00247,此时R2=0.9995(图3)。标准曲线线性回归方程相关系数大于0.9900,浓度范围覆盖关注浓度的0%~150%,符合《GB/T27417—2017合格评定化学分析方法确认和验证指南》的要求。
图3 维生素A标准溶曲线
采用标准偏差法,选择阴性样品(即试样中本身不含有维生素A)试样,称取10份,每份称取5.00g左右,按标准方法进行检测按检出限的表示方法为3倍标准偏差(结果见表2),定量限为LOD的3倍。称完阴性样品后每个样品中加入390μL,浓度为1.9153μg/mL的维生素A标准工作液。按照标准方法进行后续处理,并计算出标准偏差,以及LOD和LOQ。
从表2及图4的结果可见,液体乳试样称样量为5.00g,定容体积为10 mL时,维生素A方法检出限为3.98μg/100g,方法定量限为11.90μg/100g。低于该方法规定的检出限和定量限(称样量为5.00g,定容体积为10 mL时,维生素A的紫外检出限为10.00μg/100g,定量限为30.00μg/100g)。
表2 维生素A方法检出限与定量限结果
图4 10次加标试验数据叠加
母乳和牛乳中不同时期实验分组测定维生素A含量见表3。
通过表3数据对比,母乳初乳期中维生素A含量略高于牛乳中维生素A的含量,但母乳维生素A的含量会随着哺乳时间的增长和饮食习惯的变化显著减小。
表3 牛乳和母乳不同时期分组维生素A含量
液相色谱法测定维生素A含量检出灵敏度一般,因此,本文在设计实验时,对《GB 5009.82—2016食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定》方法中维生素A的检出限和定量限进行了论证,通过采用更新型仪器设备,增加样本量来提高灵敏度的方法。对于成分复杂的母乳通用性更强,测定数据更准确。反向高效液相紫外检测器测定牛乳和母乳中维生素A,前处理简便,仪器基线稳定,重现性好,检测灵敏度高,可以满足分析要求,为以后母乳和牛乳中维生素A测定方法提供参考。
本文在进行实验设计时,较其他同类文章针对母乳在初乳期,过渡期和成熟期3个时期维生素A含量进行采样分析,发现母乳中的维生素A会随着哺乳期的深入而逐渐减小,为以后研发婴幼儿配方奶粉、细化婴幼儿喂养需求提供了更为细致的数据支撑[7]。相对于母乳来说,在哺乳后期应该更佳注重富含维生素A营养物质的食物的摄入,例如芒果、木瓜以及多种绿叶蔬菜,来提高自身母乳中维生素A的含量。对于缺乏维生素A的婴幼儿,应食用添加维生素A营养强化剂的婴幼儿配方奶粉[8]。通过对母乳和牛乳维生素A含量测定进行了分析比较,牛乳作为最广泛的奶制品,为牛乳液态配方奶中维生素A含量添加提供了一定的理论基础。