雌二醇对小鼠急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

钱鲁，李卓远，张素勤

温州医科大学附属第二医院，浙江 温州 325027，1.心内科；2.心电图室

急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。目前能够改善急性心肌梗死患者预后的药物均有一定降压作用，对于心源性休克、血压偏低的患者有一定应用限制。因此，如何改善急性心肌梗死患者的预后，仍是当今研究的热点。急性心肌梗死的基本病理生理基础是心肌缺血再灌注损伤及氧化应激。AMPK是细胞内应激应答的核心。MIF-AMPK信号通路是一条新发现的细胞信号通路[1-2]。缺血心脏释放心肌巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor， MIF），MIF促进AMPK激活，促进下游葡萄糖的转运[2]和抑制游离脂肪酸分解。ISO-1为选择性MIF抑制剂， 能选择性地结合MIF的互变异构酶活性位点，从而抑制MIF的一些生物学功能[3]。乙酰辅酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）是制约脂肪酸合成第一阶段速度的限速酶。

人体内分泌的天然雌激素为雌二醇、雌酮及雌三醇。多项研究表明雌二醇与MIF的表达相关[4-6]，而雌二醇在心肌缺血再灌注损伤急性期中的保护机制目前尚无定论。本研究通过探讨雌二醇在心肌缺血再灌注损伤中与MIF-AMPK信号通路的相互作用，为急性心肌梗死的治疗提供新的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 一抗试剂包括MIF、AMPK、p-AMPK、ACC、p-ACC单克隆抗体均购自美国CST公司。雄性C57BL/6小鼠购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，实验动物许可证号：SCXK（沪）2017-0012。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及分组：按照随机数字表法将6～8周龄的雄性C57BL/6小鼠分为6组，每组10只：①空白组：无任何试剂处理，无缺血再灌注；②对照组：无任何试剂处理，缺血再灌注；③雌二醇溶媒（中链甘油三酯）组（溶媒1）：在再灌注前30 min腹腔注射2 mg/mL中链甘油三酯（与雌二醇组等量）；④ISO-1溶媒组（溶媒2）：在再灌注前30 min腹腔注射DMSO（与雌二醇+ISO-1组等量）；⑤雌二醇组：在再灌注前30 min腹腔注射雌二醇1 mg/kg；⑥雌二醇+ISO-1组：在再灌注前30 min腹腔注射雌二醇1 mg/kg及ISO-1 10 mg/kg。

1.2.2 心肌缺血再灌注模型[2]：用异氟烷吸入麻醉后，小鼠气管插管，用小鼠呼吸机进行机械通气，用加热板维持小鼠体温37 ℃，开胸，在左心耳下方2 mm处用7-0尼龙线结扎前降支40 min（后期心脏B超检查及TTC染色）或10 min（后期取心脏行Western blot实验）后松开缝线再灌注，逐层关闭胸腔，移除小动物呼吸机，置于电热毯保温。

1.2.3 心脏功能检测[2]：前降支结扎40 min后松开缝线再灌注48 h。通过经胸心脏超声检测左室射血分数（ejection fractions，EF）、左室短轴缩短率（fraction shortening，FS）。左室FS=（左心室舒张末期内径-左心室收缩末期内径）/左心室舒张末期内径×100%。左室EF=（左室舒张末容积-左室收缩末容积）/左室舒张末容积×100%。通过TTC染色检测梗死面积。心肌梗死面积百分率=梗死区（infarct size，INF）/缺血危险区（ratio of the area at risk，AAR）×100%。

1.2.4 心肌MIF蛋白、AMPK及ACC磷酸化程度检测：前降支结扎10 min后松开缝线再灌注10 min，Western blot检测心肌MIF蛋白、AMPK及ACC活化程度。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雌二醇保护缺血再灌注急性期心脏收缩功能，使用ISO-1后保护作用明显减弱 雌二醇组小鼠EF较对照组明显改善（P＜0.01），FS也有所改善（P＜0.01）。ISO-1拮抗MIF作用后雌二醇+ISO-1组的EF较雌二醇组有所下降（P＜0.01），FS也明显下降（P＜ 0.01）。见图1。

图1 心脏超声检测各组小鼠左室EF和FS

2.2 雌二醇减少缺血再灌注急性期心肌梗死面积，应用ISO-1后梗死面积增大 雌二醇组心肌梗死面积较对照组明显减低（P＜0.001），ISO-1抑制MIF作用后梗死面积较雌二醇组增加（P＜0.05），与对照组比差异无统计学意义（P=0.242）。见图2。

图2 雌二醇对缺血再灌注急性期心肌梗死面积的影响

2.3 雌二醇保护心肌梗死后心功能的机制 雌二醇组MIF相对表达量较对照组高（P＜0.001），雌二醇组p-AMPK及p-ACC相对表达量均较对照组高（P＜0.01），而IS0-1作用后p-AMPK及p-ACC相对表达量明显减少（P＜0.05）。见图3。

图3 雌激素及ISO-1对MIF及其下游AMPK、ACC信号通路的作用

3 讨论

流行病学调查发现冠心病的患者主要为中老年男性及绝经后女性。年轻女性冠心病的发病率远小于相同年龄的男性，而这种差距在女性绝经期后迅速缩小。在绝经期后，女性中冠心病的发病率急剧上升[7-8]。多年来，女性这种对冠心病的“相对免疫”，被归因为雌激素的保护作用。首先，雌二醇对血脂具有调控作用。雌二醇通过上调肝脏低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）受体的表达、降低肝脂蛋白脂肪酶活性、减轻LDL的氧化修饰等途径降低循环中LDL水平；雌二醇促进肝分泌胆汁酸，从而使胆固醇在肝脏的排出增多，降低体内胆固醇水平[9]。其次，雌二醇对血管内皮细胞具有调控作用。雌激素可以促进一氧化氮（NO）、前列环素（prostaglandin I2，PGI2）和内皮来源超极化因子（endothelium derived hyperpolarizing factor， EDHF）等血管舒张因子的产生，抑制内皮素-1 （endothelin-1，ET-1）的生成，减少内皮细胞活性氧的生成，从而改善血管内皮功能；并可以促进内皮的完整性，减少其对促动脉粥样硬化因子的通透性；抑制血管内皮细胞表面黏附分子的表达，从而减少炎症细胞的黏附和迁移；还可以抑制血管内皮细胞的凋亡并促进其增殖和生存[10-11]。也有研究报道雌二醇通过ET-1的作用，对受损心肌细胞和血管内皮细胞具有强大的修复作用，并促进心肌梗死后心功能的改善[12]。研究显示小鼠心肌缺血再灌注后使用雌二醇对心脏表现出保护作用，其机制可能为增加线粒体Cx43的含量和磷酸化水平[13]、上调生物钟基因Per2[14]、增强内皮祖细胞归巢及血管生成能力[15]。另有研究表明，雌二醇通过抑制外周免疫细胞分泌MIF，从而抑制炎症反应，促进皮肤外伤的愈合[6，16]。在子宫内膜异位症患者中，血清雌二醇水平升高与子宫内膜MIF表达上调相关[4]，并且MIF的表达能够被雌二醇受体拮抗剂氟维司群阻断，被雌二醇选择性激动剂上调[5]。但目前，雌二醇在心肌缺血再灌注急性期的作用与MIF-AMPK信号系统的关系未见相关研究。

在本研究中，雌二醇作用下缺血再灌注损伤后心肌梗死面积较对照组减小，心脏超声检查提示左室EF及FS较对照组升高，表明雌二醇处理对急性缺血再灌注损伤后心脏功能具有保护作用。

心肌缺血再灌注损伤及氧化应激是急性心肌梗死的核心病理生理过程。AMPK是细胞内应激应答的核心，它能够调控能量代谢以促进ATP的合成。在心脏中缺血缺氧导致ATP耗竭、AMP累积，后者激活AMPK，从而恢复ATP的产生。AMPK信号通路能够促进葡萄糖和脂肪酸的吸收、储存和代谢。MIF是一种同源三聚体蛋白质，能够在局部抑制巨噬细胞游走，促进炎症反应的发生[17]。心肌细胞在缺血条件下MIF-AMPK信号通路受损，导致能量代谢能力的减弱，影响对缺血性损伤的耐受能力[18]，这是缺血再灌注损伤心功能的重要机制。AMPK下游的ACC磷酸化水平是心肌能量物质中游离脂肪酸代谢程度的重要指标。进一步的研究表明，在心肌梗死早期（6 h内），外周血MIF主要来自心肌细胞分泌，与心肌细胞膜上的CD74等MIF受体结合进入心肌细胞，通过MIF-AMPK信号系统，发挥调节底物代谢、抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用[19]。我们的前期研究发现，冠心病患者血清中MIF水平较对照组高，不稳定性心绞痛患者血清中MIF水平比稳定性心绞痛患者高[20]。

本研究结果显示雌二醇作用后AMPK及ACC磷酸化水平增高。这表明雌二醇作用后游离脂肪酸氧化代谢受到抑制，梗死心肌能量代谢改善，推测这是雌二醇保护急性心肌梗死后心脏功能的一种可能的机制。而雌二醇作用下心肌组织MIF表达升高，其对AMPK-ACC信号通路的激活促进作用能被MIF抑制剂ISO-1拮抗，这表明雌二醇对AMPK及ACC的作用可能通过MIF实现，与MIF-AMPK信号通路相关。

综上所述，雌二醇可能通过MIF-AMPK信号通路，改善心肌缺血再灌注急性期心肌代谢，增强心肌对缺血再灌注损伤的抵御能力。雌二醇作为人体本身存在的激素，短期使用无明显降血压作用，这对于急性心肌梗死患者可能具有良好耐受性，本研究结论可为雌二醇在心肌缺血再灌注急性期的应用提供依据。鉴于患者长期使用雌二醇存在血栓形成、卒中、乳腺癌、焦虑样行为等风险[21]，因此，心肌梗死急性期雌二醇应用时限有待进一步研究。