哮喘患儿血清miR-29b与外周血Th1、Th2细胞失衡的相关性研究

马媛媛 钟斌 黄冬平 徐建锋 王伟光 李文成 邱桂霞

支气管哮喘是一种儿童时期常见的以气道炎症、气道阻塞、气流受限、气道高反应等为主要特征的慢性气道疾病。近年来由于遗传、对疾病认知不足、过敏性疾病史等因素影响，我国儿童支气管哮喘发病率呈逐年上升趋势[1]。有研究表明，辅助性T细胞亚型1(T helper 1 cells，Th1)/辅助性T细胞亚型2(T helper 2 cells，Th2)比例失衡可能通过促进免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)分泌增多诱导嗜酸粒细胞、肥大细胞增殖，进而促进炎性因子生成和气道高反应发生并引发哮喘[2]。有研究发现，支气管肺发育不良婴儿血浆微小核糖核酸-29b(Micro Ribonucleic Acid 29b，miR-29b)表达水平降低，与患病严重程度呈负相关，miR-29b表达上调可通过调节炎性反应改善肺泡形成[3]。Chi等[4]研究报道，miR-29b在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织中表达下调，可能介导Th1/Th2分化、相关炎性因子和气道上皮重构调节。本研究通过检测支气管哮喘患儿血清中miR-29b表达水平，分析与Th1/Th2失衡及相关炎性因子、患儿肺功能水平关系，探究miR-29b在儿童支气管哮喘发生发展中的意义，为临床评估病情及治疗提供一定的理论依据，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年5月至2019年5月广东省妇幼保健院和清远市妇幼保健院收治的支气管哮喘患儿104例为研究对象，其中男56例，女48例；年龄4～12岁，平均年龄(8.16±2.53)岁。根据患儿临床病情进展[5]分为急性发作组51例，临床缓解组53例。另选取同期在本院体检健康儿童48例为健康对照组，其中男29例，女19例；年龄(5～12)岁，平均年龄(8.39±2.76)岁。研究组和健康对照组年龄及性别比比较，差异无统计学意义(P>0.05)。受试者家属均已对本研究知情并签署知情同意书，本研究经本院伦理委员会批准同意。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①根据中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[5]，确诊为支气管哮喘；②临床资料完整；③能积极配合本研究。

1.2.2 排除标准：①合并患有过敏性鼻炎、喘息性疾病者；②合并患有系统性红斑狼疮、银屑病等自身免疫性疾病；③ 3个月内使用过糖皮质激素或免疫抑制剂治疗。

1.3 主要仪器 实时荧光定量(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)仪(型号：7900，美国Applied Biosystems公司)、流式细胞仪(型号：FACSCalibu，美国Becton Dickinson公司)、肺功能检测仪(型号MasterScreen，德国Jaeger公司)、qRT-PCR试剂盒(货号：3914001，德国Roche公司)、总RNA提取试剂盒(货号：73404，德国Qiagen公司)、反转录试剂盒(货号：205311，德国Qiagen公司)、酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(批号：ab178013，美国Abcam公司)。

1.4 方法

1.4.1 样本采集:入组哮喘患儿于入院后第2天清晨(健康对照组于体检时)空腹采集外周静脉血5 ml，其中2 ml经离心后分离上清液于-80℃保存，用于qRT-PCR及ELISA实验；另外3 ml使用EDTA抗凝，Ficoll梯度离心法分离外周血单个核细胞，用于Th1、Th2细胞检测。常规收集所有受试儿童体重、血清总IgE、外周血嗜酸性粒细胞计数及肺功能指标1 s量(forced expired volume，FEV1)、用力肺活量(forced Vital Capacity，FVC)、最高呼吸气流(peak expiratory flow，PEF)等一般资料。

1.4.2 血清miR-29b表达水平检测:采用qRT-PCR法检测血清miR-29b表达水平。Trizol法提取总RNA、反转录得到cDNA后用于qRT-PCR实验。反应体系(20 μl)如下：Mix 10 μl，ROX 0.4 μl，cDNA 2 μl，6.0 μl ddH2O，上游引物0.8 μl，下游引物0.8 μl。反应步骤如下：95℃、5 min，1循环；95℃、15 s，62℃、1 min，以上40个循环。采用2-ΔΔCT法计算miR-29b相对表达量。见表1。

表1 qRT-PCR引物

1.4.3 外周血Th1、Th2细胞水平检测:采用流式细胞术检测外周血Th1、Th2细胞水平。设置对照管和检测管后分别加入FITC-CD4、IgG、PE-干扰素-γ(interferon γ，IFN-γ)、PE-白介素-4(interleukin 4，IL-4)。以CD4、IFN-γ双阳性为Th1细胞，CD4、IL-4双阳性为Th2细胞。

1.4.4 血清Th1、Th2相关细胞因子水平检测:采用ELISA法检测血清IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 急性发作组、临床缓解组及健康对照组一般资料比较 急性发作组、临床缓解组及健康对照组年龄、性别比、体重比较，差异无统计学意义(P>0.05)。健康对照组、临床缓解组、急性发作组患儿外周血嗜酸性粒细胞、血清总IgE水平依次显著升高(P<0.05)，肺功能指标FEV1、FVC、PEF水平依次显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 急性发作组、临床缓解组及健康对照组一般资料比较

2.2 急性发作组、临床缓解组及健康对照组血清miR-29b、外周血Th1、Th2水平比较 急性发作组患儿血清miR-29b、外周血Th1、Th1/Th2水平明显低于临床缓解组患儿及健康对照组(P<0.05)，外周血Th2水平明显高于临床缓解组患儿及健康对照组(P<0.05)。临床缓解组患儿血清miR-29b、外周血Th1、Th1/Th2水平明显低于健康对照组(P<0.05)，外周血Th2水平明显高于健康对照组(P<0.05)。见表3。

表3 急性发作组、临床缓解组及健康对照组血清miR-29b与外周血Th1、Th2水平比较

2.3 急性发作组、临床缓解组及健康对照组血清相关细胞因子水平比较 健康对照组、临床缓解组、急性发作组血清IL-2、IFN-γ水平依次显著降低(P<0.05)，血清IL-4、IL-5、IL-6、IL-10水平依次显著升高(P<0.05)。见表4。

表4 急性发作组、临床缓解组及健康对照组血清相关细胞因子水平比较

2.4 哮喘患儿血清miR-29b与外周血Th1/Th2水平相关性 急性发作期及临床缓解期哮喘患儿血清miR-29b与外周血Th1/Th2水平均呈正相关(r=0.421，P=0.000；r=0.441，P=0.001)。见图1、2。

图1 急性发作期哮喘患儿血清miR-29b与Th1/Th2水平相关性

2.5 哮喘患儿血清miR-29b与相关炎性指标及细胞因子水平相关性 哮喘患儿血清miR-29b与外周血嗜酸性粒细胞计数、血清总IgE、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10水平呈负相关(P<0.05)，与血清IL-2、IFN-γ水平呈正相关(P<0.05)。血清miR-29b与哮喘患儿肺功能指标FEV1、FVC、PEF水平呈正相关(P<0.05)。见表5、6。

图2 临床缓解期哮喘患儿血清miR-29b与Th1/Th2水平相关性

表5 哮喘患儿血清miR-29b与相关炎性指标及细胞因子水平相关性

表6 哮喘患儿血清miR-29b与肺功能指标相关性

3 讨论

儿童期支气管哮喘症状以胸闷、气急、喘息、咳嗽为主，患儿常出现上呼吸道感染、肺功能变化明显，严重影响患儿身心健康。研究认为，树突状细胞、嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞等参与的机体免疫失衡和炎性反应发生在支气管哮喘发病调控中有重要作用[6]。

Tang等[11]研究发现，慢性阻塞性肺疾病患者血浆中miR-29b表达下调，可能通过调控炎性细胞因子表达参与患者气道炎症，与慢性阻塞性肺疾病严重程度有关。本研究结果显示，健康对照组、临床缓解组、急性发作组哮喘患儿血清miR-29b表达水平依次显著降低，提示miR-29b表达水平降低可能预示哮喘发生发展。Apolline等[12]研究报道，自身免疫性糖尿病小鼠模型中miR-29b低水平，与自身免疫引起的炎性反应发生有关。Suzanne等[13]研究表明，癌症放疗过程中引起的血管疾病与慢性炎症激活有关，miR-29b过表达可通过下调炎性因子表达抑制血管炎性反应，提示miR-29b低表达可能与哮喘进展中炎性反应发生有关。

综上所述，健康对照组、临床缓解组、急性发作组血清miR-29b水平依次显著降低，miR-29b低表达可能通过调控Th1/Th2比例失衡，影响相关炎性细胞因子变化，促进哮喘发生发展。但由于本研究方法较为简单，尚需通过进一步实验探究相关机制。