石斛碱对糖尿病肾病大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路及足细胞功能障碍的影响

樊小宝 丁通 孙燕 吴冰 王晶 杜鹏

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的常见并发症之一，临床特征以糖脂代谢紊乱、肾功能进行性减退、持续性蛋白尿为主，致残、致死率高，可导致终末期肾病，是引起糖尿病患者死亡的主要原因[1,2]。足细胞作为肾小球滤过屏障结构的主要构成部分，抑制肾内足细胞病理损伤是改善DN临床症状的关键[3]。PI3K/Akt/mTOR信号可调控细胞存活、凋亡及自噬、炎症、氧化应激等生理、病理过程，激活该通路可抑制炎性反应，减轻神经元凋亡，改善神经功能[4]，并可减轻自噬相关炎症，减轻肾小管上皮细胞凋亡，改善肾功能，保护肾组织免于损伤[5]。PI3K/Akt/mTOR信号可能是改善DN大鼠足细胞功能障碍的潜在治疗靶点。石斛碱是我国传统名贵中药石斛的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎的功效，可滋阴益胃、清热生津，对糖尿病具有较好疗效[6]。研究发现，金钗石斛可抑制糖尿病大鼠肾组织TGF-β1表达，对肾脏发挥明显的保护作用[7]，石斛合剂能下调TNF-α及IL-6的表达，减轻肾内炎性反应，缓解肾脏损伤，进而延缓DN病情进展[8]。但石斛碱是否可影响DN大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路表达及足细胞功能障碍，目前还不清楚，本文通过建立DN大鼠模型，进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF清洁级SD大鼠，广东省医学实验动物中心，动物质量合格证号44007200021086，生产许可证号SCXK(粤)2016-0002，雄性，体重200～240 g，饲养条件：温度22～25℃，相对湿度50%～60%，12 h/12 h间断照明，自由进食、饮水，环境保持清洁、安静、通风良好，在本院动物房中饲养1周后用于实验。

1.2 主要试剂及仪器 石斛碱，上海士锋生物科技有限公司，货号EB07670；盐酸二甲双胍片，中美上海施贵宝制药有限公司，大鼠PCX ELISA试剂盒，路非凡生物科技公司，货号：YDE04398；大鼠nephrin ELISA试剂盒，上海恒斐生物科技有限公司，货号：CSB-E13957r-1；大鼠IL-6及TNF-α ELISA试剂盒、兔源GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR及p-mTOR一抗、羊抗兔二抗，美国Abcam公司，货号ab100772、ab100785、ab181602、ab151549、ab138364、ab179463、ab38449、ab2732、ab84400、ab150077；RIPA裂解液、BCA试剂盒、HE染色试剂盒，上海碧云天公司，货号P0013K、P0011、C0105等。BX-4000全自动生化分析仪，南京新惠通生物科技有限公司；XElx800酶标仪，美国 Perkin Elmer公司；RM2016病理切片机、EG1160包埋机、HI1220烤片机，上海徕卡仪器有限公司；NIKON ECLIPSE CI正置光学显微镜；1659001蛋白电泳仪、Trans-Blot Turbo转膜仪，美国Bio-Rad公司；GIS-500凝胶成像仪，Miulab公司等。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备及分组给药:参考文献中方法[8]，SD大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉，摘除左肾，置于鼠笼中喂养1周，以60 mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素，72 h后随机测量血糖，2次>16.7 mmol/L，于12周末测得24 h尿微量白蛋白量>30 mg时，表示糖尿病肾病大鼠模型建立成功，共建模64只，成功60只。随机分为模型组、石斛碱低剂量组、石斛碱中剂量组、石斛碱高剂量组、二甲双胍组5组，每组12只，另取12只SD大鼠于麻醉后仅做开腹处理，不摘除左肾，喂养1周后等剂量腹腔注射生理盐水设为假手术组。参照文献[9-11]，石斛碱、二甲双胍片溶于生理盐水配制为2、4、8 mg/ml石斛碱溶液、二甲双胍[12]溶液，14 mg/ml的溶液，药物处理组大鼠以10 ml/kg的剂量灌胃，假手术组与模型组大鼠以同剂量0.9%氯化钠溶液灌胃，持续14 d。

1.3.2 大鼠生化指标检测及标本收集:末次给药结束后24 h，收集大鼠24 h尿液，混匀后取2 ml储存在-80℃冰箱中备用。尾静脉取血4 ml，静置后离心，收集上清液，获得血清，取其中一半置于全自动生化分析仪中，参照其说明书检测大鼠生化指标血糖、血脂、UMA水平，剩余血清储存在-80℃冰箱中备用。将大鼠麻醉后处死，解剖取出肾脏，剪取约0.5 g肾组织储存在液氮中备用，剩余组织以0.9%氯化钠溶液漂洗干净，置于4%多聚甲醛固定，以低浓度到高浓度的乙醚脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，最后以切片机做常规病理切片备用。

1.3.3 大鼠肾组织病理形态检测:1.2.2中的切片，选取完好的进行脱蜡、高浓度到低浓度酒精浸泡处理，参照HE试剂盒说明书进行染色，经0.9%氯化钠溶液漂洗后，再次进行脱水、透明处理后采用中性树胶封片，以光学显微镜观察肾组织病理形态并任选5个视野拍照。

1.3.4 大鼠尿液nephrin、PCX水平及血清IL-6、TNF-α水平检测:取出1.2.2中的尿液、血清置于4℃冰箱中解冻，以ELISA试剂盒检测其中nephrin、PCX、IL-6、TNF-α水平，具体步骤参照说明书进行。

1.3.5 大鼠肾组织PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达检测:将1.2.2中的肾组织剪碎置于蛋白裂解液中，以匀浆机匀浆后制备为匀浆液，离心提取总蛋白，参照BCA试剂盒的说明书测定其总蛋白浓度，然后将其调整至各组样品液浓度，取相同体积样品液上样，进行电泳，分离蛋白后将其转移至PVDF膜上，经5%脱脂奶粉封闭2 h(室温)，根据目的蛋白分子量截取蛋白条带，以稀释比例为1∶1 000的兔源GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR及p-mTOR一抗孵育过夜(4℃)，以TBST溶液漂洗后以稀释比例为1∶1 000的羊抗兔二抗孵育2 h(室温)，最后经增强化学发光法显色后以凝胶成像系统拍照，以Quantity One软件分析条带，得出各组蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 石斛碱对糖尿病大鼠血糖、血脂、UMA水平的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血糖、血脂、UMA水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较，石斛碱低、中、高剂量组及二甲双胍组大鼠血糖、血脂、UMA水平降低(P<0.05)，且石斛碱各组呈剂量依赖性，石斛碱高剂量组与二甲双胍组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 6组血糖、血脂、UMA 水平比较

2.2 石斛碱对糖尿病大鼠肾组织病理形态的影响 假手术组大鼠肾组织结构正常，足状突起排列有序，清晰可见；模型组大鼠肾组织出现肾小球基底膜局部增厚，足状突起排列紊乱呈带状结构，局部突起融合、变平，贴敷于基底膜等病理损伤；与模型组相比，石斛碱低、中、高剂量组及二甲双胍组大鼠肾组织病理损伤均不同程度地减轻，并呈剂量依赖性；石斛碱高剂量组与二甲双胍组比较，肾组织病理损伤程度差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.3 石斛碱对糖尿病大鼠尿中nephrin、PCX蛋白含量的影响 与假手术组比较，模型组大鼠尿中nephrin、PCX蛋白含量显著升高(P<0.05)。与模型组比较，石斛碱低、中、高剂量组及二甲双胍组大鼠尿中nephrin、PCX蛋白含量降低(P<0.05)，且石斛碱各组呈剂量依赖性，石斛碱高剂量组与二甲双胍组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 6组糖尿病大鼠尿中nephrin、PCX蛋白含量比较

2.4 石斛碱对糖尿病大鼠血清IL-6、TNF-α水平的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清中IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较，石斛碱低、中、高剂量组及二甲双胍组大鼠血清中IL-6、TNF-α水平含量降低(P<0.05)，且石斛碱各组呈剂量依赖性，石斛碱高剂量组与二甲双胍组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 6组大鼠血清IL-6、TNF-α水平比较

2.5 石斛碱对糖尿病大鼠肾组织PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达比较 与假手术组比较，模型组大鼠肾组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR显著降低(P<0.05)。与模型组比较，石斛碱低、中、高剂量组及二甲双胍组大鼠肾组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高(P<0.05)，且石斛碱各组呈剂量依赖性，石斛碱高剂量组与二甲双胍组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2，表4。

图2 免疫印迹检测各组大鼠肾组织中PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达;A 假手术组；B 模型组；C 石斛碱低剂量组；D 石斛碱低剂量组；E 石斛碱低剂量组；F 二甲双胍组

表4 6组大鼠肾组织PI3K/Akt/mTOR通路蛋白相对表达比较

3 讨论

DN是糖尿病的主要并发症，足细胞损伤是其超微观病理变化，也是蛋白尿持续发生、DN病情进展的主要病理基础。足细胞为附着于肾小球基底膜外侧的上皮细胞，与肾小球基底膜、内皮细胞共同构成肾小球滤过屏障，因糖尿病肾脏足细胞长期处于高糖环境中，其细胞内活性氧的生成增多[11]，诱导促炎因子IL-6、TNF-α大量合成释放[12]，引发严重的炎性反应，造成足细胞凋亡，其标志蛋白nephrin、PCX[15]进入尿液中，导致蛋白尿产生。本文以腹腔注射链脲佐菌素的方法建立DN大鼠模型，结果显示，建模大鼠肾组织呈现肾小球基底膜局部增厚，足状突起排列紊乱呈带状结构，局部突起融合、变平，贴敷于基底膜等病理损伤，大鼠血糖、血脂、UMA、TNF-α及IL-6水平、尿中nephrin、PCX蛋白含量显著升高，表明链脲佐菌素可破坏大鼠正常的糖脂代谢，引发肾组织严重的炎性反应，造成足细胞凋亡，引发蛋白尿，提示模型建立成功。

石斛为《神农本草经》中的上品药物，具有清热、滋阴、益胃、生津的功效，是治疗糖尿病的重要药物，石斛碱是其最主要的有效成分，可促使糖脂代谢恢复正常，抑制肾内炎症发生发展，减轻肾脏损伤[6-8,15,16]。本研究以石斛碱处理DN模型大鼠，结果显示，石斛碱可减轻DN大鼠肾组织足细胞病理损伤，降低血糖、血脂、UMA、TNF-α及IL-6水平、尿中nephrin、PCX蛋白含量，且呈剂量依赖性，表明石斛碱可恢复DN大鼠正常糖脂代谢，减轻肾脏炎症，缓解蛋白尿症状，改善足细胞功能障碍，并随剂量升高而作用增强。

PI3K/AKT/mTOR作为机体调控氧化应激、炎性反应、细胞凋亡等多种生理病理过程的信号，在DN发生发展过程中起到重要调控作用。PI3K/AKT/mTOR信号是DN的治疗靶点之一，激活该通路提高其磷酸化水平，可抑制肾组织炎性反应，抑制足细胞凋亡，减轻蛋白尿症状[5,17]。但石斛碱是否可影响DN大鼠PI3K/Akt/mTOR信号传导，目前还不清楚。本文对此进行研究，结果显示，DN模型大鼠肾组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR显著降低，表明PI3K/AKT/mTOR信号参与介导DN大鼠足细胞功能障碍。经石斛碱处理后，DN大鼠肾组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高，且石斛碱各组呈剂量依赖性，表明石斛碱可激活PI3K/AKT/mTOR信号，可能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，改善DN大鼠足细胞功能障碍，减轻肾脏损伤。

综上所述，石斛碱可促进PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白磷酸化，调节糖脂代谢恢复正常，降低炎性因子表达，阻止肾脏炎性反应发生发展，抑制足细胞凋亡，修复受损足细胞功能，激活PI3K/Akt/mTOR通路可能是其药理机制，但本文只做了初步研究，未曾使用PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂及激动剂进行对照验证，存在一定不足，关于石斛碱治疗DN大鼠的确切作用机制还有待后续深入研究。