早期激素性股骨头坏死动物模型制备的实验研究*

石包圣，闫国珍，李爱华，李志远，何俊峰，刘 扬

(1.内蒙古科技大学包头医学院研究生学院2018级研究生，内蒙古包头 014060；2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院病房超声科)

股骨头坏死为常见的骨科疾病，股骨头坏死致病机制尚未研究清楚，构建合适的动物模型可为治疗提供新的选择方案，研究致病过程中机体的变化。目前制备早期股骨头坏死的方法有单激素制备法、激素联合其他因子制备法、酒精制备法。Yamamoto等[1]首先对实验兔注射大剂量甲泼尼龙，43 %的实验动物发生血小板减少症、低纤维蛋白原血症及严重的股骨头坏死。Bai等[2]研究发现单激素制备股骨头坏死动物模型需要长期持续给予大剂量激素，制备时间长，且多次注射仅增加股骨头坏死率，但病灶范围及严重程度无明显变化。在研究激素联合异体物质过程中，内毒素可造成血管内皮损伤、炎症反应增加，股骨头坏死发生率、血液微循环发生障碍率增加。Yamamoto等[3]注射内毒素联合大剂量激素改良股骨头坏死制备方案，成模率升至85 %，但死亡率随之升至50 %，证明减少内毒素使用剂量降低实验动物死亡率。因此，添加异体物质可使实验动物骨内外血管处于高凝状态，缩短制备时间，但会增加引起过度免疫反应几率，造成实验动物死亡。

本实验用内毒素联合不同剂量激素制备早期股骨头坏死。在实验动物选择方面，兔子体型中等，动物资源较易获得，饲养难度低，且可通过顶端给水使实验动物长期处于站立状态，使实验兔的受力方式更接近人类，故本实验选用兔为实验动物[4]。骨陷窝中骨细胞消失情况的发生是股骨头坏死发生病理诊断标志，因此本实验通过比较各组空骨陷窝阳性率明确早期股骨头坏死制备情况[5]。本实验首先使用小剂量内毒素联合臀部肌肉注射不同剂量激素构建早期股骨头坏死，明确激素最佳使用时间，其次在超声引导下向关节腔内注射激素，观察制备早期股骨头坏死动物模型，观察是否可以减少构建动物模型的时间，以便为快速简便制备股骨头坏死提供新的研究方法及思路。

1 材料与方法

1.1材料 新西兰白兔(包头医学院动物实验中心提供)；甲基强的松龙(天津金耀药业有限公司)；内毒素(北京寰宇科创生物科技发展有限公司)；青霉素钠(济南允诚生物科技有限公司)；生理盐水(石家庄四药有限公司)；戊巴比妥钠(上海榕柏生物技术有限公司)；靶向药物微泡造影剂(上海博莱科信谊药业有限责任公司)。

1.2动物模型制备方法 将35只实验动物随机分为7组，顶端供水、供食，分笼适应性饲养2周后进行分组：(1)A组：空白对照组；(2)传统组：传统制备法为内毒素联合臀部肌肉注射20 mg/kg甲基强的松，根据注射激素时间分为B组(3 d)、C组(5 d)、D组(7 d)；(3)改良组：超声制备改良法为内毒素联合超声下关节腔注射激素，根据激素注射时间分为E组(3 d)、F组(5 d)、G组(7 d)。首先传统制备法和超声制备改良法均经耳缘静脉注射10 μg/kg内毒素，随后注射激素，制备早期股骨头坏死动物模型。用戊巴比妥钠(0.7 mL/kg)麻醉动物，将其仰卧位固定四肢于实验台，碘伏消毒，下肢外展，超声引导下将22 G穿刺针送入关节腔内，拔出针芯注射0.2 mL生理盐水，明确穿刺针位置，更换注射器向关节囊内注射等剂量激素；空白对照组注射等量生理盐水。

实验兔继续饲养4周后，经耳缘静脉空气栓塞法处死动物，取出双侧股骨头及干垢端，用福尔马林液固定3 d后，每周更换脱钙液脱钙，直至穿刺针轻易穿刺插入脱钙组织，终止脱钙；取材脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，病理切片行病理形态学观察。

1.3观察指标

1.3.1一般情况 给药后3组动物食量、脱毛情况、体重及步态变化。记录实验动物死亡时间，并立即解剖分析死因，统计各组死亡数量。

1.3.2影像学观察 (1)二维彩超检查方法：术前使用脱毛剂对耳缘静脉、股骨头观察区域备皮，耳缘静脉注射戊巴比妥钠麻醉，实验兔取仰卧位，四肢固定于实验台，碘伏消毒，下肢外展，使用9 MHz浅表探头扫查兔股骨头长轴，观察骨皮质及关节腔形态。(2)超声造影检查：用5 mL生理盐水溶解造影剂，用力振摇直至冻干粉末完全分散。经耳缘静脉注入声诺维造影剂0.4 mL，同时启动计时器，检查时保持探头不动，连续观察2 min，并存储动态影像。观察股骨头周围血供情况，有无血管数目减少。(3)X射线平片观察观察股骨头骨皮质是否连续完整，有无骨质缺损，有无出现新月征(crescent sign)或坏死灶被硬化骨包绕及节段性塌陷。

1.3.3病理学检查 光镜下观察组织学切片，观察股骨头形态学变化及病理学改变，任选5个400倍视野，记数视野内的全部骨陷窝数和空骨陷窝数，计算空骨陷窝阳性率=(空骨陷窝数/全部骨陷窝数)×100 %。

2 结果

2.1一般情况 传统组注射激素7 d后进食量增大，14 d时开始出现饮食差，活动度减低，臀部激素注射区域出现区域性脱毛，21 d时出现精神萎靡，稀便。改良组注射后出现上述情况早于传统组3 d，关节腔注射激素后，2只兔穿刺部位渗血，下肢肿胀，给予穿刺部位纱布包扎及白眉蛇毒凝血针1 kU皮下注射后，下肢肿胀好转。

2.2影像学观察

2.2.1二维超声及造影表现 对照组股骨头骨皮质完整，表面光滑，未见骨赘形成，关节囊无积液，周围软组织未见水肿，彩色多普勒(CDFI)可见周边可见丰富血流信号，传统组、改良组股骨头形态结构及超声表现未见明显异常。超声造影显示对照组围血管显影良好，未见局部充盈缺损，传统组及改良组股骨头周围血管显影数目减少。见图1。

图1 股骨头二维超声及造影图

2.2.2X线影像学表现 对照组、传统组及改良组股骨头骨皮质连续完整，改良组少部分股骨头可见骨密度不均，但无特异性表现，未见骨质弥漫性病变、囊性病变，未见微骨折及股骨头坏死特征性表现“新月征”或坏死灶被硬化骨包绕及节段性塌陷。见图2。

图2 股骨头X线显像比较

2.3病理学检查及相关数据统计分析 空白对照组股骨头颜色润白，股骨头及软骨形态完整，无缺损，骨质硬，切割阻力大，软骨表面光滑、骨细胞、软骨细胞排列整齐，骨小梁排列规则整齐，空骨陷窝细胞少见，可见正常脂肪细胞分布。传统组及改良组病理：部分骨细胞排列紊乱，间质血管扩张、淤血，随激素注射时间延长，脂肪细胞数量增多，骨小梁数目减少，分布稀疏，两组动物模型均未见骨小梁断裂。

传统组及改良组与对照组行空骨陷窝阳性率比较，三组间比较采用方差分析，其中注射3 d的各组空骨陷窝阳性率，差异无统计学意义(P>0.05)，注射时长为5 d、7 d的各组空骨陷窝阳性率，差异有统计学意义(P<0.05)；改良组空骨陷窝阳性率均高于传统组(P<0.05)。见图3、表1。

图3 对照组、传统组、改良组病理学改变

表1 各组兔股骨头坏死空骨陷窝细胞率(%)

3 讨论

在制备激素性股骨头坏死中，内毒素可增加股骨头坏死发生率。喻钧伦等[6]发现，单纯内毒素注射实验动物死亡率高达80 %，而使用小剂量内毒素联合激素方法死亡率仅为18 %，注射5 μg/kg内毒素联合甲强龙第8周成功造模。我们的预实验发现，注射10 μg/kg内毒素后实验动物活动差，精神差，出现1只实验动物死亡，给予青霉素及间隔24 h后给予实验性激素后，动物一般情况改善。针对于上述情况，后期实验给予提前12 h预防性注射青霉素，10 min内缓慢推注内毒素，后期实验中无动物死亡。顶端给水可使实验动物站立，使其受力接近人类，但未长期持续性站立，相关因素仍未能量化，下一步需设计相关饲养笼使实验动物长期站立，使其长时间保持受力与人类相近；而且在食物方面，兔为素食性，是否可改变其食物谱来缩短构建股骨头坏死动物模型时间仍可进行相关研究。

本实验行超声及X线未见到特殊性新月征表现，但目前在严重股骨头坏死中可发现微骨折，而早期股骨头坏死仅表现为空骨陷窝细胞异常，在早期及晚期股骨头坏死的渐变过程中目前无标准，下一步实验可延长造模时间，观察出现微骨折时间，为中晚期激素性股骨头坏死的实验模型构建提供相关数据。田媛媛等[7]研究发现，注射内毒素及激素导致骨质内微血管数目减少，行病理学微血管计数发现模型组数目较空白组减少，但本实验未进行骨质微血管相关研究，下一步可推进相关骨质微循环MRI表现及病理学表现的相关研究。

近年来超声仪器分辨率的提高和超声介入技术提升使超声微创治疗及诊断快速发展。超声监视下制备动物模型具有微创性、安全性、快速性、有效性，避免部分并发症发生等优势，目前在心脏骤停模型，肺部肿瘤、心包积液、关节出血、重症胰腺炎[8-10]的实验动物制备中发挥了重要作用。本实验通过超声引导下注射激素，可实时明确穿刺部位及周围有无血管，避免损伤周围血管造成对于股骨头供血影响，确保穿刺针进入关节囊腔内，大幅度提升了目标区域的药物浓度，避免了大剂量激素对于实验动物的全身性损伤，穿刺过程中观察关节周围出血及渗液情况，必要时给予抗凝对症治疗。根据本实验结果，改良组的空骨陷窝细胞数目数量多于传统组。减少药物注射时间，可降低因持续药物注射导致的实验动物死亡。但兔关节囊腔容积量小，并且术后兔下肢活动度大，导致关节腔内药物因肌肉挤压而外渗，影响药物吸收，因此如何修改注射部位及明确最佳药物浓度可作为下一步研究方向。本实验为注射激素后继续饲养四周，后续实验可延长饲养时间观察延长饲养时间能否增加股骨头空骨陷窝细胞发生率。

综上所述，超声引导下制备股骨头坏死可缩短实验动物制备时间，具体实验方法可进一步改进，为制备相关实验动物模型提供新思路。