PTEN基因mRNA在卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌的诊断价值

方 燕，陈建欧，郑旭旭

(温州市中医院病理科，浙江 温州 325000)

卵巢癌是女性发生率较高的生殖器官恶性肿瘤，其发病率仅次于宫颈癌及子宫体癌[1]。目前，临床上对于卵巢癌发病机制尚未阐明，普遍认为与遗传因素、内分泌因素等有关，临床表现多以疼痛为主，部分患者可伴有下腹包块、月经不调等[2]。PTEN基因是除p53基因外的第二大抑癌基因，主要定位于在10号染色体上，具有双重特异性[3]。研究表明，PTEN的脂质磷酸酶活性拮抗磷脂酰肌醇-3-激酶(PIEK)/AKT/mTOR途径抑制肿瘤细胞的生长和存活[4]。故PTEN的突变与缺失能参与多种肿瘤细胞的发生、发展，促进细胞凋亡，诱导细胞周期的停止，且PTEN基因的低表达或缺失与肿瘤的进展和不良预后存在相关性。此前研究证据提示，PTEN基因突变及表达能直接参与卵巢癌的发生、发展，能通过多种途径调控细胞的增殖与迁移[5]。因此，本研究以卵巢癌及良性上皮性卵巢肿瘤患者为对象，探讨卵巢癌患者PTEN基因突变情况、mRNA表达水平及其对卵巢癌的临床诊断价值，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选择2016年1月至2020年2月在温州市中医院进行诊治的卵巢癌患者58例为观察组，观察组年龄介于28～52岁，平均年龄(35.79±5.73)岁；肿瘤直径介于2～7cm，平均直径(4.34±0.63)cm；组织学分型为：浆液性囊腺癌21例，粘液性囊腺癌18例，卵巢内膜性癌14例，透明细胞癌5例；组织分化程度为：高分化7例，中分化37例，低分化14例；临床分期为：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期24例。选择同期进行治疗的良性上皮性卵巢肿瘤患者71例为对照组，对照组年龄介于29～53岁，平均年龄(36.11±5.74)岁。研究对象的纳入标准为：①符合卵巢癌和良性上皮性卵巢肿瘤的诊断标准[6]；②均行手术治疗，术中留取病灶组织；③均完成PTEN基因突变及mRNA水平测定，且患者均可耐受；④对本研究知情且同意参加者。排除标准：①合并认知功能异常、自身免疫系统疾病者；②患者留取病灶组织前已接受激素或放化疗治疗；③合并精神异常、其他部位肿瘤或严重肝肾功能异常者。经对比，两组患者的一般资料无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。本研究方案已经由温州市中医院伦理委员会审核及批准，且所有研究对象均已签署知情同意书。

1.2检测方法

1.2.1 PENT基因突变测定

所有患者均行手术治疗，且术中留取病灶组织，并将获得的组织立即放置在液氮中，完成30min速冻后，将其放置在-70℃冰箱中；部分病灶组织采用浓度为10.0%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋后，制备4μm切片备用。采用实时荧光定量PCR技术完成不同组织中PTEN基因突变部位，并完成扩增，正向引物：5′-TCCAATAGAAAAATGGTG-3′；反向引物：5′-TGCCCCGATGTAATAAAT-3′；引物长度196nt。取上述经PCR扩增的引物3μL，根据1∶5的比例放置在变性剂(含有甲酰胺98.0%、NaOH溶液200mmol/L、EDTA 20mmol/L、溴酚蓝0.05%及二甲苯青0.05%)中充分混合，在98℃下完成10min变性，完成后立即完成5min水浴。取上述获得的混合溶液，完成聚丙烯酰胺凝胶电泳，从而获得银染显带，将DNA异常的扩增产物送外检，完成相应序列的测定[7]。

1.2.2 PENT mRNA表达水平测定

取上述分离的组织标本，向标本中加入Trizol 500μL，充分混合后转移到离心管1.0mL，振荡5min后，静置。向各组标本中加入氯仿200μL，振荡15s，静置5min后离心15min，离心速度12 000rpm。完毕后加入预冷的乙醇(浓度为75.0%)1mL，常温下放置7min至干燥，经紫外分光度仪A260下测定吸光度值。采用实时荧光定量PCR技术测定各组样品中PENTmRNA的表达水平。根据实验需要完成PCR参数设置：30℃下10min；42℃下30min；99℃下5min；5℃下5min，合计完成循环35个，72℃下10min延长，获得最终产物并放入1.5%琼脂凝胶电泳，β-actin为内对照，引物见表1[8]。

表1 PTEN mRNA引物设计

1.3观察指标

①观察卵巢癌组织中PTEN基因突变情况；②对比观察组和对照组的PTEN mRNA水平差异；③收集患者的年龄、病理类型、分化类型及临床分期，比较观察组不同年龄、分化类型、病理组织类型及临床分期下PTEN mRNA水平差异；④绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，分析PTEN mRNA水平在卵巢癌患者中的诊断效能。

1.4统计学方法

2结果

2.1 卵巢癌组织中PTEN基因突变

58例卵巢癌组织中，有35例检出PTEN基因突变，均为外显子5突变，多分布在中分化及低分化癌中；其中卵巢内膜性癌11例，透明细胞癌4例，浆液性囊腺癌13例，粘液性囊腺癌7例。突变部位为外显子5第5位密码子T→C，见图1。

注：突变部位为PTEN基因外显子5第5位密码子T→C。

2.2两组患者PTEN mRNA水平的比较

观察组PTEN mRNA水平为显著低于对照组(0.334±0.097 vs 0.831±0.109，t=6.391，P<0.001)，见表2。

表2 两组PTEN mRNA水平的比较

2.3不同病理特征下卵巢癌患者的PTEN mRNA表达水平

不同年龄分层下，卵巢癌患者的PTEN mRNA水平无显著差异(t=0.334，P=0.691)。不同分化类型及病理组织类型分层下，卵巢癌患者的PTEN mRNA水平分布具有显著统计学差异(F=7.891、7.998，P<0.001)临床分期为Ⅰ～Ⅱ期的卵巢癌患者PTEN mRNA水平显著高于Ⅲ～Ⅳ期患者(t=6.143，P<0.001)，见表3。

表3 不同病理特征下卵巢癌患者的PTEN mRNA表达水平比较

2.4 PTEN mRNA水平对卵巢癌的诊断价值

ROC曲线结果显示，PTEN mRNA水平诊断卵巢癌的AUC为0.873(P<0.05),最优截断点的诊断灵敏度和特异度分别为85.71%、71.23%，见图2。

图2 PTEN mRNA水平诊断卵巢癌的ROC曲线

3讨论

3.1 PTEN基因在卵巢癌细胞中的突变

卵巢癌是女性发生率较高的生殖系统恶性肿瘤，其发病率仅次于宫颈癌、子宫癌，具有较高的死亡率[9]。既往研究表明[10]，恶性肿瘤的发生与细胞凋亡存在紧密的联系。PTEN基因属于人体中较为常见的抑癌基因，位于染色体10q23，含9个外显子和8个内含子，其编码的蛋白与张力蛋白、辅助蛋白相似[11]。既往研究表明[11]，PTEN基因编码的蛋白能提高相关蛋白活性，能影响磷酸丝氨酸/苏氨酸和磷酸酪氨酸残基脱磷酸化，可负性调节细胞的运动、浸润与转移。此外，PTEN还具有脂质磷酸酶活性，通过一系列作用使细胞周期阻滞在G1期，并诱导细胞凋亡[12]。PTEN基因能借助多种信号通路、途径等抑制细胞的增殖活性，故其突变多与肿瘤的发生发展密切相关。本研究中，58例卵巢癌组织中检出35例携带PTEN基因突变，多分布在中分化、低分化癌中，且均为外显子5突变。此前研究证据也表明，PTEN基因外显子5突变将改变编码产物的磷酸酶结构域，进而使其功能异常[13]。

3.2 PTEN mRNA在卵巢癌组织中的表达及意义

本研究结果显示，观察组PTEN mRNA水平低于对照组(P<0.05)，说明PTEN基因在卵巢癌患者中呈低表达水平。且本研究还发现，卵巢癌组织中PTEN mRNA表达水平与患者的分化类型、病理组织类型及临床分期密切相关，低分化、Ⅲ～Ⅳ期及卵巢内膜性癌患者的PTEN mRNA表达水平显著下调，提示其表达水平或可反映患者的疾病严重程度，可用于辅助判断患者的病理分型、分化程度及临床分期，进而用于指导临床诊疗。且本研究结论与此前类似研究结论较为一致[14]。其原因可能降低细胞粘附和凋亡、提高细胞运动性和增值、促进心血管形成等过程相关[12]。但仍需开展更多大样本研究，进一步明确PTEN mRNA表达水平与患者的分化类型、病理组织类型及临床分期的量化关系，助力卵巢癌个体化治疗。

3.3 PTEN mRNA水平对卵巢癌的诊断价值

为了进一步分析PTEN mRNA对卵巢癌的诊断价值，本研究进一步构建ROC曲线，结果显示，PTEN mRNA水平诊断卵巢癌的AUC为0.873(P<0.05)，最优截断点的诊断灵敏度和特异度分别为85.71%、71.23%，提示较高的诊断价值。故临床上应加强卵巢癌患者的PTEN基因测定，以便于评估患者分期、疾病严重程度，并根据测定结果制定治疗方案，促进患者恢复。

综上所述，卵巢癌患者常伴有PTEN基因突变，该基因mRNA水平可能因分化类型、病理组织类型及临床分期的分布而异，且对卵巢癌的诊断具有重要价值，有望成为卵巢癌治疗的新靶点。