电芒针对脊髓横断大鼠运动功能及损伤区域GAP-43、SOD、Caspase-3及iNOS表达的影响*

高 潇，陶嘉隆，王艳丽，齐德玉，董施秋△

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江护理高等专科学校，黑龙江 哈尔滨 150080)

脊髓横断损伤是脊髓损伤(SCI)中最严重的分类，多由于脊髓受外力作用导致脊髓完全离断伴局部水肿及出血，在病理层面表现为脊髓组织完全离断、损伤区域内神经元毒性水肿及凋亡坏死，最终出现脊髓物理上的完全损伤，脊髓完全损伤层面以下各种功能完全丧失。随着我国社会经济的不断发展、人民生活水平的不断提高、人口老龄化及汽车保有量的不断提升，坠落、外伤、跌倒及交通意外等因素导致的SCI呈爆发式增长，特别是脊髓完全损伤的致残性，其治疗方法的基础研究就显得意义重大[1-4]。Caspase-3被称为死亡蛋白酶,是一种特殊的胞浆蛋白酶，Caspase-3活化后可以通过内质网影响Ca2+的调控，致使诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活化激活NO信号通路引起氧化应激反应，借此启动与执行神经元的凋亡；超氧化物歧化酶(SOD)可以抑制氧化应激反应，阻断神经元凋亡的进程[5-6]。GAP-43可以通过改变蛋白的活性促进神经元再生和突触重构，GAP-43还可以通过骨架蛋白介导轴突的延长达到神经元功能的重构。SCI后导致功能障碍的主要原因是神经元的损伤与凋亡，SCI患者功能障碍的恢复原因主要是轴突的修复和重建，因此GAP-43、SOD、Caspase-3和iNOS在SCI的康复中具有重要的作用[5-7]。综上所述，应用电芒针干预SCI大鼠模型，观察损伤区域Caspase-3、iNOS、GAP-43和SOD表达的变化及BBB评分变化，探讨电芒针对SCI大鼠模型运动功能的改善及可能的机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

购自黑龙江中医药大学药物安全性评价中心健康雄性SPF级成年SD大鼠36只，体质量(200±20)g，许可证号SCXK(黑)2013-004。饲养环境严格满足实验设计，室温(24±2)℃，湿度50%～70%，亮/暗周期为7:00/19:00(人工)，受试大鼠适应性饲养1周,每笼饲养5只，造模前24 h禁食水，造模后独笼饲养，垫料24 h更换1次，更换垫料时使用过氧乙酸对笼具喷洒消毒。

1.2 仪器与试剂

电针仪(江苏华佗，SDZ-2型)；芒针针具(贵州安迪，0.30 mm×25 mm)；酶标仪(美国BIOTEK，ELX-800型)；紫外可见光分光光度计(湖南湘仪，UV752型)；双垂直蛋白电泳仪(北京六一，DYCZ-24DN型)；凝胶成像分析仪(北京六一，WD-9413B型)；SOD法测定试剂盒(南京建成，A001-1)；Western洗涤液(沈阳万类，WLA025)；内参抗体(沈阳万类，WL01845)；Caspase-3抗体(沈阳万类，WL02117)；GAP-43抗体(沈阳万类，WL00641)；iNOS抗体(沈阳万类，WL0992)。

2 实验方法

2.1 动物分组

将受试大鼠应用随机数字列表赋予3位编号进行随机化处理并应用苦味酸标注，随机分为假手术组(Sham，12只)、模型组(Model，12只)及电芒针组(Treatment，12只)，造模成功及入组评价标准应用BBB评分。

2.2 模型制备

2.2.1 模型制备前准备 待制备大鼠适应性喂养7 d，模型制备前12 h禁食水，造模前应用10%水合氯醛(剂量为30 mg/kg)腹腔注射完成待造模大鼠的麻醉，待进行模型制备[8-11]。

2.2.2 模型制备方法 将麻醉后的待造模大鼠腹卧固定于操作台，通过触及大鼠T7～T9脊椎棘突(T7～T9脊椎棘突比其他棘突明显增大)确定T8棘突位置，以T8棘突为中心，局部剔除鼠毛后碘伏消毒，应用手术刀沿棘突中线切开皮肤、浅筋膜及肌肉，切口长度大约为4 cm，清理术野并止血，用显微撑开器钝性分离并固定椎旁肌肉并暴露T7～T9棘突，后应用眼科剪清除T7～T9棘突并暴露椎板，进一步剃除椎板、椎弓周围结缔组织后暴露T10节段脊髓，清理术野并止血后取脊髓探针，脊髓探针为去除针尖并对断端进行钝化处理的眼针(贵州安迪，0.25 mm×25 mm)，其远端应用止血钳弯曲成半圆环，从一侧脊髓腹侧穿至对侧，轻轻上提脊髓，确定探针下方为椎管且脊髓组织完好后，将两侧端与刀架固定，应用消毒后犀牛刀片制作的5 mm宽微型刀片，将T10节段脊髓沿刀架方向(刀架方向与试验台呈90°角)垂直切断，清理术野并止血后应用消毒粉、凝胶海绵覆盖消毒固定横断脊髓，逐层缝合术口。

2.2.3 模型制备成功标志 ①模型制备完成后，脊髓探针可从脊髓断端中滑出且脊髓断端呈外翻样;②模型大鼠后肢抖动并迅速痉挛回缩之后呈完全松弛性瘫痪;③BBB评分为0分。

2.2.4 术后护理 造模成功后模型大鼠保暖2 h待其清醒后分笼饲养，环境温度控制在(23±2)℃，每日更换垫料以保持干燥清洁，每日腹部按摩帮助其排二便，排便后清洁会阴区以预防压疮及肠梗阻。造模成功后模型大鼠每日腹腔注射青霉素20万单位持续注射1周以预防感染。

2.3 干预方法

2.3.1 假手术组 该组受试大鼠麻醉后，应用眼科剪清除T7～T9棘突并暴露椎板，进一步剃除椎板、椎弓周围结缔组织后暴露T10节段脊髓后，应用消毒粉、凝胶海绵覆盖消毒覆盖脊髓后逐层缝合术口。分笼正常饲养，不进行其他干预。自由饲养3 d，于7、28 d后完成BBB评定及取材。

2.3.2 模型组 模型制备完成3 d后，每日上午9:00—10:00，固定受试模型大鼠15 min后释放，1次/d。干预7、28 d上午完成BBB评定及取材。

2.3.3 电芒针组 模型制备完成3 d后，每日上午9:00—10:00，固定受试模型大鼠，捏术口瘢痕上端轻轻提起皮肤，应用芒针针刺夹脊及膀胱经(夹脊定位沿棘突连线两侧旁3 mm处)。单日夹脊刺法：T6脊椎水平45°进针破皮后沿皮下结缔组织水平继续进针至T10脊椎水平处；膀胱经刺法：T10胸椎下两旁与肋间交点处45°进针破皮后沿皮下结缔组织水平继续进针至T6胸椎下两旁与肋间交点。双日夹脊刺法：T10脊椎水平45°进针破皮后沿皮下结缔组织水平继续进针至T6脊椎水平处；膀胱经刺法：T6胸椎下两旁与肋间交点处45°进针破皮后沿皮下结缔组织水平继续进针至T10胸椎下两旁与肋间交点[12-14]。同侧两针接电针仪(江苏华佗，SDZ-2)，调2 Hz疏密波，强度为(14±2)mV，表现为针周围肌肉呈轻微抖动状态，每次持续15 min，1次/d。治疗后7、28 d上午完成BBB评定及取材。

2.4 受试大鼠BBB评定、取材及指标检测

受试大鼠BBB评定：脊髓损伤主要以四肢瘫痪和截瘫为主要表现，大鼠脊髓损伤截瘫模型主要表现为后肢运动功能障碍，BBB评分主要用于评定受试大鼠的后肢运动功能，可评定为22个等级，0分最低，分值越高运动功能越好，28分以上为正常[15-17]。评定在1个0.01 m2光滑的评定板上进行。动物取材方法：各组受试大鼠于干预7、28 d后麻醉，暴露T6～T10脊椎内脊髓组织，以T10节段为中心截取5 mm损伤区域内脊髓置入液氮罐内备用。分光光度计评价与分析：损伤区脊髓组织打碎匀浆，再应用酶标仪进行蛋白定量分析用分光光度计测定OD值，带入公式计算出SOD的表达情况。Western Blot评价与分析：损伤区脊髓组织裂解液融化提取蛋白质后进行蛋白质定量测定后，进行电泳转印封闭，后用凝胶图像处理系统分析获得胶片。

2.5 统计学分析

3 实验结果

3.1 各组大鼠干预前后BBB评分变化

通过观察和分析研究所获得的BBB评分数据后发现，假手术组大鼠不同时间段BBB评分均为28分，为正常大鼠BBB评分。模型组及电芒针组大鼠在造模后BBB评分均为0分。分别干预7 d及28 d后，模型组及电芒针组大鼠BBB评分与假手术组大鼠BBB评分比较，差异均具有统计学意义(P<0.01)。分别干预7、28 d后，模型组与电芒针组之间差异具有统计学意义(P<0.05)，电芒针组大鼠BBB评分高于模型组大鼠BBB评分。见表1。

表1 各组大鼠干预前后BBB评分变化

3.2 各组大鼠干预后脊髓前角损伤区域GAP-43和Caspase-3表达值的变化

通过观察和分析研究所获得的脊髓前角损伤区域GAP-43表达值数据后发现：各组大鼠在分别干预7、28 d后，模型组及电芒针组模型大鼠脊髓前角损伤区域GAP-43表达数据均与假手术组同节段脊髓前角区域GAP-43表达数据比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。分别干预7、28 d后，模型组与电芒针组模型大鼠之间脊髓前角损伤区域GAP-43表达数据差异具有统计学意义(P<0.05)，电芒针组大鼠脊髓前角损伤区域GAP-43表达数据多于模型组。

通过观察和分析研究所获得的脊髓前角损伤区域Caspase-3数据后发现：各组大鼠在分别干预7、28 d后，模型组及电芒针组模型大鼠脊髓前角损伤区域Caspase-3表达数据均与假手术组同节段脊髓前角区域Caspase-3表达数据比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。分别干预7、28 d后，模型组与电芒针组模型大鼠之间脊髓前角损伤区域Caspase-3差异有统计学意义(P<0.05)，电芒针组大鼠脊髓前角损伤区域Caspase-3表达数据少于模型组。见表2、图1～2。

表2 各组大鼠干预后脊髓前角损伤区域GAP-43和Caspase-3表达的变化

图1 各组大鼠干预后脊髓前角损伤区域GAP-43表达的变化

图2 各组大鼠干预后脊髓前角损伤区域Caspase-3表达的变化

3.3 各组大鼠干预后脊髓前角损伤区域SOD与iNOS表达的变化

通过观察和分析研究所获得的脊髓前角损伤区域SOD表达数据后发现：各组大鼠在干预7 d时，各组大鼠脊髓前角损伤区域SOD表达比较，差异均具有统计学意义(P<0.01)，电芒针组SOD表达多于模型组。各组模型大鼠在分别干预28 d时，各组大鼠脊髓前角损伤区域SOD表达比较，差异均具有统计学意义(P<0.01)，电芒针组SOD表达多于模型组。

通过观察和分析研究所获得的脊髓前角损伤区域iNOS表达数据后发现：各组大鼠在干预7 d时，各组大鼠脊髓前角损伤区域iNOS表达比较，差异均具有统计学意义(P<0.01)，电芒针组iNOS表达少于模型组，差异具有统计学意义(P<0.01)。各组大鼠在分别干预28 d时，各组大鼠脊髓前角损伤区域iNOS表达比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，电芒针组iNOS表达少于模型组，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表3、图3。

表3 各组大鼠干预后脊髓前角损伤区域SOD和iNOS表达的变化

图3 各组大鼠干预后脊髓前角损伤区域iNOS表达的情况

4 讨论

SCI在中医学中属于“痿证”范畴，主要病机是外伤致脊髓、督脉与足太阳膀胱经受损，督脉与足太阳膀胱经经气运行受阻，气血不能循督脉与足太阳膀胱经输布，故所支配的骨、筋、肉和皮失于濡养，出现肢体痿废失用、肌肤甲错不仁；本病病位在脊髓，与督脉、足太阳膀胱经密切相关，督脉主一身之阳，为阳脉之海，膀胱经与所有脏腑都有密切联系，故治疗外伤痿病多选针刺膀胱经与督脉，受试大鼠T6～T10椎管已不完整，所以在治疗时以针刺督脉旁夹脊与膀胱经为主[4，18]。芒针为上古九针之一，承于长针，其体长,善于沿经脉透刺，这种刺法取穴少、效力强，笔者应用芒针透刺受试大鼠夹脊与膀胱经，以调督脉与足太阳膀胱经气血、疏通枢机，力求“疏针力专”、通调经脉气血之效[14，19]。通过分析本研究所获得的BBB评分数据发现，电芒针组受试大鼠BBB评分明显高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示应用电芒针干预后，受试模型大鼠运动功能得到明显的恢复。

横断SCI是脊髓受外力作用导致脊髓完全损伤伴局部水肿及出血，主要病理机制为完全损伤区域内神经元毒性水肿及凋亡坏死；主要症状是完全损伤脊髓层面以下各种神经功能完全丧失[3，20]。基于SCI主要病理机制，一些临床研究认为Caspase-3与iNOS在其中起到了重要的作用，SCI一旦发生，Caspase-3与iNOS在损伤区域内会大量活化，活化的iNOS可激活NO通路，加重神经元损伤，进一步导致Caspase-3的活化，活化后的Caspase-3可以通过内质网影响Ca2+的调控，造成损伤区域内神经元出现Ca2+超载并导致神经元毒性水肿，最终出现不可逆的神经元凋亡[5-7]。通过分析本研究所获得的脊髓前角损伤区域Caspase-3与iNOS表达数据后发现，电芒针组受试大鼠脊髓前角损伤区域 Caspase-3与iNOS表达明显低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。这些数据提示电芒针干预可以使脊髓前角损伤区域 Caspase-3与iNOS表达减少，抑制了NO信号通路的同时抑制了氧化应激反应，同样抑制了损伤区域内神经元出现Ca2+超载并导致神经元毒性水肿，最终挽救了一些脊髓神经元。这些数据结合BBB评分结果提示电芒针组模型大鼠运动功能的恢复可能与脊髓前角损伤区域 Caspase-3与iNOS表达减少有关。GAP-43是促进神经元再生和突触重构的重要因子，GAP-43可以通过改变蛋白的活性及促进由骨架蛋白介导轴突延长促进损伤神经元的修复、抑制神经元的凋亡；SOD可以抑制氧化应激反应，阻断神经元凋亡的进程，二者可以共同抑制损伤的脊髓神经元出现不可逆的坏死[5,7]。通过分析本研究所获得的脊髓前角损伤区域GAP-43与SOD表达数据后发现，电芒针组受试大鼠脊髓前角损伤区域GAP-43与SOD表达明显高于模型组。这些数据提示电芒针干预可以使脊髓前角损伤区域GAP-43与SOD表达增多，增多的GAP-43与SOD因子可以阻断氧化应激反应及改变蛋白的活性以抑制神经元的凋亡；可以通过促进由骨架蛋白介导轴突延长而促进损伤神经元的修复。这些数据结合BBB评分结果提示电芒针组模型大鼠运动功能的恢复可能与脊髓前角损伤区域GAP-43与SOD表达增多有关。

综上所述，电芒针可能通过抑制脊髓前角损伤区域 Caspase-3与iNOS的表达、促进脊髓前角损伤区域GAP-43与SOD的表达，抑制脊髓损伤后的氧化应激反应，减少SCI导致的神经元的损伤及凋亡，促进神经元的修复及功能重构，从而改善脊髓横断模型大鼠的运动功能、提高BBB评分。