钠⁃钾⁃氯协同转运蛋白1相关神经系统疾病研究进展

付旭阳 孙健淇 吕军 石瑞丽

钠⁃钾⁃氯协同转运蛋白1（NKCC1）作为人体内的重要离子转运体，主要介导钠、钾、氯等离子由细胞外向细胞内转运，对氯离子稳态的调控发挥重要作用。NKCC1存在多个磷酸化位点和启动子甲基化位点，与其表达与活性调控密切相关，在多种神经系统疾病的发病过程中均能观察到NKCC1的异常变化［1］。布美他尼作为NKCC1特异性抑制剂，可用于多种神经系统疾病的治疗，如低剂量布美他尼用于治疗小儿孤独症，可改善社交、互动和兴趣受限行为［2］；针对动物缺血⁃再灌注脑损伤模型的研究显示，布美他尼还可通过抑制NKCC1活性而发挥脑保护作用［3］。基于此，本文拟综述NKCC1的最新研究进展并分析将NKCC1作为治疗靶点治疗神经系统疾病的可能性，为疾病防治提供新的研究思路。

一、NKCC1的结构与功能

1.NKCC1结构 钠⁃钾⁃氯协同转运蛋白（NKCCs）属于Slc12a家族，该家族包含数个基因，如编码NKCC2的Slc12a1基因、编码NKCC1的Slc12a2基因、编码钠⁃氯协同转运蛋白（NCC）的Slc12a3基因、编码钾⁃氯协同转运蛋白（KCC）1~4的Slc12a4⁃7基因等［4］。人类NKCC1共包含1212个氨基酸残基，转录本为7.4 kb，相对分子质量131.4×103，其编码基因位于第5号染色体［5］。NKCC1拥有较大的氨基端（N端）和羧基端（C端），N端大部分无序，包含调控区域，其中的氨基酸磷酸化状态决定了NKCC1的生物活性，不同物种的NKCC1蛋白N端具有序列多样性［6］。人类细胞试验显示，NKCC1蛋白的N端具有糖基化修饰，约25%的NKCC1蛋白N端为复杂型N⁃糖基化，其余75%的NKCC1蛋白N端为高甘露糖糖基化和混合糖基化［7］。NKCC1蛋白经翻译修饰后，约10%到达质膜，且大部分为高甘露糖型，其余90%的NKCC1蛋白分布在细胞内，其N端糖基化在NKCC1的协同转运功能中发挥重要作用，但尚无证据表明糖基化与蛋白质在细胞内的定位有关［7］。NKCC1蛋白C端高度保守且与阳离子⁃氯化物协同转运蛋白家族呈高度同源，其作用目前尚不明确，期待未来进行深入研究探讨。

2.NKCC1功能 NKCC1表达广泛，除外分泌上皮细胞，其在心脏、骨骼肌神经元等非分泌上皮细胞中也有分布。既往研究证明，NKCC1表达于中枢神经系统的全脑神经元、神经胶质细胞、脉络丛上皮细胞、血管内皮细胞和周围神经系统的背根神经节感觉神经元［4］；而近期有研究发现，脑卒中、胶质细胞瘤等中枢神经系统疾病亦可导致NKCC1表达异常［1，8］，同时NKCC1还参与不同组织细胞的离子稳态调节、细胞体积和质量调节，以及神经元信号转导等正常生理功能［9］。正常情况下，Na+⁃K+⁃ATP酶提供能量并将钠离子和钾离子转运至细胞外，而NKCC1以继发主动转运的方式消耗能量进行离子跨膜转运，介导钠、钾、氯离子向细胞内转运，调节离子稳态［9］。研究显示，NKCC1通过离子转运方式改变细胞渗透压，调节细胞体积，在高渗环境下，细胞失水皱缩需触发适当的调节机制以增大细胞体积，此时NKCC1被激活，介导离子向细胞内泵入，完成细胞体积的调节；当细胞处于低渗状态时，细胞吸水膨胀，NKCC1呈低活性状态，相反，KCC2被激活，介导钾离子和氯离子外流，渗透压降低，水分子随之流出细胞，恢复细胞体积［10］。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白1（mTOR1）受上游的生长因子和必需氨基酸调控，调节细胞生长［11］，近期研究发现［12］NKCC1对L型氨基酸转运载体1（LAT1）和细胞表面抗原4F2重链（4F2hc）所形成的LAT1⁃4F2hc复合体发挥负调控作用，其在调控LAT1的同时降低mTOR1活性，通过此途径参与细胞的生长调节。γ⁃氨基丁酸（GABA）是重要的抑制性中枢神经递质，其受体为离子门控通道，当该通道被激活时，氯离子可由此流出或流入细胞。在正常生理状态下，成人中枢神经系统KCC2呈高表达、NKCC1呈低表达［4］，当氯离子细胞内浓度低于细胞外时，GABA受体被激活，氯离子内流，细胞超极化；而在病理状态下，NKCC1表达升高，氯离子转运至细胞内，细胞内氯离子浓度升高，此时若GABA受体被激活，反使氯离子内流减少、胞膜超极化水平降低，甚至发生氯离子外流、细胞去极化［13］。上述研究提示，NKCC1可通过调控细胞内氯离子浓度，改变中枢神经系统GABA的生物学效应。不同神经元中NKCC1的作用有所不同，例如在视交叉上核中，大部分神经元可产生GABA作为神经元之间的转导信号，GABA亦可使大部分神经元产生抑制性电位［14］，但有研究显示，视交叉上核背侧和腹侧的GABA可以产生兴奋性电位，并且这种兴奋性作用可被NKCC1抑制剂布美他尼所阻断［15］。总结上述两项研究可以发现，GABA兴奋和抑制电位的产生系由NKCC1功能状态所决定的，NKCC1活跃时，氯离子浓度升高、产生兴奋性电位，反之，则产生抑制性电位，提示这两种不同的电位与NKCC1所介导的不同的细胞内氯离子浓度变化有关。晚近研究显示，NKCC1表达受视交叉上核内环境光照调控［16］，NKCC1 mRNA在视网膜色素上皮细胞亦存在节律性表达，NKCC1表达量的改变可导致GABA产生不同的生物学效应，进而参与调节昼夜节律［17］。

二、NKCC1表达与活性的调控

NKCC1在人类胎儿期呈高表达，KCC2呈低表达，随着年龄的增长，NKCC1表达逐渐降低，KCC2表达逐渐升高，使GABA介导的神经元离子电化学反应由超极化向去极化转变［18］。研究显示，在胎儿成长过程中其体内的NKCC1活性随着母体循环中催产素水平的增加而逐渐降低，使GABA能信号产生抑制性电位，后者在分娩过程中产生的镇痛和神经保护作用可帮助胎儿适应分娩时的不良刺激，此为胎儿抗神经损伤的一种生理学机制［19］。而在病理或特定环境下，NKCC1的表达会因蛋白质磷酸化、DNA甲基化或炎性细胞因子刺激等因素的影响而发生改变［20⁃22］。

1.NKCC1的表达调节 研究显示，转录因子信号转导及转录激活蛋白2（STAT2）的可结合位点位于NKCC1转录起始点上游的30和500 bp处［23］，但有关STAT2对NKCC1表达变化的影响至今尚不十分清楚。DNA甲基化是表观遗传学机制之一，由DNA甲基转移酶（DNMT）催化完成。DNA高甲基化与基因转录阻遏相关，DNA低甲基化可促进基因转录。在正常情况下，大鼠Slc12a启动子甲基化水平随其月龄的增加而逐渐升高，随着DNA甲基转移酶活性的增强，可使NKCC1的表达维持在低水平状态；而自发性高血压模型大鼠体内的DNA甲基转移酶活性则随其月龄的增加而呈逐渐衰减趋势，Slc12a基因启动子呈低甲基化水平，这可能是NKCC1在自发性高血压人群中呈高表达的重要病生 理 学 机制［24］。Unal等［25］发现，与 健 康 对 照组 相比，颞叶癫 患者病灶组织中NKCC1甲基化水平表达异常，提示NKCC1可能通过甲基化改变其表达量，从而参与难治性颞叶癫 的发病过程。Lee等［1］采用DNA甲基转移酶抑制剂5⁃azadC处理正常大鼠皮质组织切片，发现5⁃azad C可显著提高NKCC1的表达；对大脑中动脉闭塞（MCAO）缺血大鼠模型的观察亦发现脑缺血损伤大鼠皮质NKCC1相关mRNA和蛋白质表达水平均升高，且患侧大脑皮质Slc12a外显子1区DNA甲基化程度明显低于健侧，推测与NKCC1 mRNA及其蛋白质重新表达有关。该研究结果提示，DNA甲基化参与对NKCC1表达的调控。除此之外，一些炎性因子亦与NKCC1的表达变化存在一定关联性。Weidenfeld和Kuebler［26］发现，肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α）等炎性因子可上调急性肺损伤模型小鼠NKCC1的表达水平，TNF⁃α缺陷模型小鼠小脑及大脑皮质NKCC1表达均降低，注射TNF⁃α后其NKCC1表达显著升高［27］，提示TNF⁃α具有促进NKCC1表达的作用。原代星形胶质细胞实验显示，TNF⁃α或白细胞介素⁃1β（IL⁃1β）可显著增加NKCC1相关mRNA和蛋白质的表达，并可随其体内浓度的降低而下调［28］。但上述研究仍不能明确炎性因子激活NKCC1表达的作用是否具有特异性，其他细胞因子是否也参与炎性损伤时对NKCC1表达的调节。

2.NKCC1的活性调节 1992年，Lytle和Forbush［29］首次报告NKCC1磷酸化对其功能的影响：NKCC1抑制剂布美他尼注射于经高渗溶液皱缩的鲨鱼直肠腺细胞内即可见细胞内钾离子浓度迅速升高，该作者认为细胞内钾离子浓度的变化与NKCC1蛋白中丝氨酸和苏氨酸残基发生磷酸化有关。后续研究发现，NKCCs家族的生物活性与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（WNK）、STE20/SPS⁃1相关性脯氨酸⁃丙氨酸激酶（Spak）和氧化应激反应激酶（OSR1）磷酸化有关。与正常小鼠相比，Spak基因敲除小鼠感觉神经元NKCC1活性下降2倍，表明Spak参与了NKCC1的活化过程［30］。WNK3激活NKCC1的信号转导通路需Spak/OSR1的参与，Spak/OSR1与WNK3在其Thr233和Thr185两个氨基酸位点结合，通过已磷酸化的WNK3 T环激活Spak/OSR1，活化的Spak/OSR1磷酸化NKCC1氨基末端多个苏氨酸（Thr203/Thr207/Thr212），从 而 激 活NKCC1［31］。根据Gagnon和Delpire［32］在2010年的研究报告，蛋白磷酸酶参与NKCC1蛋白的去磷酸化，并进一步证实NKCC1的去磷酸化机制。晚近研究表明，与Spak结合的钙结合蛋白39（Cab39）能够激活NKCC1，注射编码Cab39的cDNA可使Spak分子形成二聚体，从而激活NKCC1［33］。其他通过磷酸化调节NKCC1活性的因素包括环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）、钙离子等第二信使［19］，但在不同物种、组织中其影响有所不同［5］，第二信使通过与细胞内信号级联的组织特异性中间体相互作用，而并非与离子本身相互作用而影响NKCC1的活性表达。

三、NKCC1与神经系统疾病

研究表明，在组织器官损伤过程中均有NKCC1的异常表达，且参与多种疾病的病理生理学机制，例 如急性肺 损伤［16］、肝 性脑病［17］、铅中毒［23］等，尤其是脑卒中、癫 、胶质细胞瘤或精神分裂症等中枢神经系统疾病与其关系密切相关。

1.NKCC1与脑卒中 离子稳态失衡是脑缺血诱导细胞损伤的重要机制，而阳离子⁃氯化物协同转运蛋白不仅在神经元氯离子稳态调节中发挥作用，而且对维持血⁃脑屏障通透性、星形胶质细胞和神经元细胞内正常离子浓度，以及细胞容积同样至关重要［34］。缺血性脑损伤发生后，细胞外钾离子浓度升高，大量谷氨酸自细胞内释放，胞内钙、钠、氯离子浓度超负荷；此时，虽然脑组织缺血⁃缺氧引起的能量代谢障碍可使Na+⁃K+⁃ATP酶分泌受抑制，但NKCC1仍可通过表达增加和活性增强进一步介导钠离子内流，使细胞内渗透压增高，由于细胞外水分向细胞内转移导致细胞水肿［35］，而且血⁃脑屏障上的NKCC1过表达使脑组织进一步摄取水分，脑水肿加剧，患者可因颅内高压而诱发脑疝并危及生命。付学军等［36］通过对大脑中动脉闭塞大鼠模型的观察发现，缺血⁃缺氧中心区星形胶质细胞的死亡方式主要以破碎为主，所见肿胀、核溶解等表现与胀亡的形态学变化相吻合，提示NKCC1导致的细胞水肿与缺血⁃缺氧中心区星形胶质细胞胀亡密切相关，而神经胶质细胞及血管内皮细胞肿胀可导致细胞间紧密连接破坏，进而破坏血⁃脑屏障，加重脑水肿［37］。此外，NKCC1导致的细胞内钠离子聚积可迅速激活Na+/Ca2+交换蛋白的反向转运，使钙离子大量进入细胞内，细胞内钙离子超载，继而引起细胞损伤［38］。此外，脑卒中后的炎症反应也可促进NKCC1的表达［27］，加剧细胞损伤。晚近研究表明，新型NKCC1抑制剂STS666对缩小脑梗死体积、保护神经元具有明显疗效［22］，因此NKCC1可能成为治疗急性缺血性卒中的重要靶点。Zeniya等［39］认为，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）具有促进Spak和NKCC1磷酸化的作用，这可能是NKCC1在缺血性卒中合并高血压患者脑组织中呈高表达的原因之一，因此对于缺血性卒中合并高血压的患者，以NKCC1为靶点可能疗效更佳。有研究显示，NKCC1亦可作为缺血性卒中后抑郁的治疗靶点，呈高表达的白细胞介素⁃18（IL⁃18）可通过IL⁃18受体/NKCC1信号转导通路引起卒中后抑郁，若以IL⁃18及其下游的NKCC1作为靶点，可能是预防和治疗缺血性卒中后抑郁颇具前景的策略［40］，但相关机制尚待深入研究。

3.NKCC1与胶质细胞瘤 胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统最为常见亦是最具侵袭性的原发性肿瘤，其对脑组织具有极强的侵袭性和浸润性。研究证实，在胶质母细胞瘤细胞的迁移过程中，为了便于在脑组织中“穿行”可通过离子转运而不断调节其体积大小，NKCC1则可通过氯离子转运快速调节肿瘤细胞的这种体积变化［28］。NKCC1在胶质母细胞瘤中呈高表达，NKCC1抑制剂可降低肿瘤细胞的扩散能力［8］。上皮间质转化（EMT）可使上皮细胞的细胞极性和细胞黏附功能消失，使上皮细胞获得迁移能力，提示上皮间质转化是肿瘤转移的关键步骤［46］。晚近研究发现，ras相关蛋白Rac1和转化蛋白RhoA通路在上皮间质转化进程中发挥关键作用，NKCC1通过Rac1和RhoA信号转导通路调控胶质母细胞瘤上皮间质转化过程［47］，从而促进肿瘤细胞的迁移。抗肿瘤药物实验发现，替莫唑胺可降低肿瘤细胞中钾离子和氯离子浓度，使肿瘤细胞体积缩小并诱导其凋亡，同时可激活WNK⁃NKCC1通路；NKCC1特异性抑制剂布美他尼可使细胞内钾离子和氯离子丢失加剧，促进肿瘤细胞凋亡［48］。总之，NKCC1可通过调节细胞体积，以及Rac1和RhoA信号转导通路参与胶质母细胞瘤的侵袭过程，抑制NKCC1表达，促进肿瘤细胞凋亡［49⁃50］，因此针对胶质母细胞瘤侵袭能力的治疗，以NKCC1作为靶点具有可行性。

4.NKCC1与精神分裂症 精神分裂症是一类重型精神病，其发病机制尚不十分清楚，通常认为与神经递质代谢紊乱有关，尤其是前额叶皮质GABA代谢异常可能与精神分裂症的神经功能障碍有关［51］。有研究显示，精神分裂症患者海马KCC2 mRNA表达下调、NKCC1/KCC2比值增加，从而影响GABA的分泌与代谢，引起神经功能障碍［52］。Spak是NKCC1发生磷酸化并被激活的“催化剂”，Spak基因敲除增强了精神分裂症模型小鼠的探索能力，而且大脑KCC2表达水平显著升高，提示改变NKCC1/KCC2比值可能改善小鼠精神分裂症相关症状［53］。研究发现，精神分裂症患者脑组织中的NKCC1随着WNK3和OSR1 mRNA表达的上调而升高，使GABA介导的细胞电位改变，参与精神分裂症的发生与发展［54］。推测NKCC1和KCC2可能是调节GABA能信号的关键环节，但是否参与神经分裂症的发病，有待进一步深入研究。

综上所述，作为重要的离子转运体，NKCC1表达变化受DNA甲基化和蛋白质磷酸化等多种因素的调节，通过对NKCC1的研究增进了对氯离子稳态调节的理解。NKCC1通过调节GABA能信号转导和细胞体积参与多种生理活动和神经系统疾病过程，因此以NKCC1为治疗靶点具有重要研究意义及应用价值。

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