花生类受体蛋白激酶基因AhBAK1的克隆及原核表达

韦莉 李霞 黄舒婷 Chanthaphoone KEOVONGKOD 何龙飞 詹洁 王爱勤 肖冬

摘 要： BAK1是富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶，参与调控植物先天免疫反应过程中的程序性细胞死亡过程。实验室已有的花生铝胁迫转录组数据揭示AhBAK1为铝胁迫响应基因。为研究其在花生抗铝机制中的作用，该文分析了铝胁迫下AhBAK1在花生耐铝品种‘99-1507和铝敏感品种‘中花2号（‘ZH2）根尖中的转录变化，采用RT-PCR技术进行扩增AhBAK1的完整CDS序列，并对序列特征进行了分析。结果表明：AhBAK1显著响应铝处理，且在‘99-1507中有着更强的诱导表达;AhBAK1包括625个氨基酸残基， 属富亮氨酸重复区类受体激酶，具跨膜域和蛋白激酶催化结构域，不存在信号肽，预测定位于细胞质膜;我们进一步构建了含有AhBAK1激酶域的pGEX-6p-1-AhBAK1-CD重组质粒，体外诱导表达出约70 kD可溶性蛋白，经凝胶亲和层析纯化，最终得到基于蛋白印迹实验（Western Blot）验证正确的重组蛋白。为进一步研究AhBAK1的生物学功能和生化功能奠定了基础。

关键词： 花生， AhBAK1， 基因克隆， 原核表达， 蛋白纯化

中图分类号： Q943

文獻标识码： A

文章编号： 1000-3142（2021）04-0573-11

Abstract： BAK1， an LRR receptor-like protein kinase， interacts with other receptor-like protein kinase and mediates the programmed cell death in plant innate immune response. Previous transcriptome analysis had revealed that AhBAK1 was responded to aluminum stress. In order to explore the role of AhBAK1 in peanuts under Al stress， the transcriptional changes of AhBAK1 between Al-tolerant cultivar ‘99-1507 and Al-sensitive cultivar ‘ZH2 under Al stress were analyzed. Furthermore， the full-length CDS of AhBAK1 was amplified by RT-PCR and analyzed. The results were as follows： AhBAK1 responded significantly to aluminum treatment， with much higher induced level in ‘99-1507. Furthermore， the full-length ORF of AhBAK1 was cloned into pMD19T vector， encoding a protein with 625 amino acids and belonging to LRR receptor-like protein kinase family. It was predicted that AhBAK1 had transmembrane and protein kinase catalytic domains， and located in plasm membrane. The recombinant plasmid of pGEX-6p-1-AhBAK1-CD was further introduced into the Rosetta （DE3） to express a 70 kD soluble protein. The purified recombinant protein was verified by Western Blot analysis. The research set a foundation for further study on biological and biochemical functions of AhBAK1.

Key words： Arachis hypogaea， AhBAK1， cloning， prokaryotic expression， protein purification

铝的化学形态依赖于pH值，在酸性土壤（pH<4.5）中，铝主要以三价阳离子形式存在，是酸性土壤中植物生长主要的限制因子之一。铝对植物毒害最先影响到根的生长，根长会受到明显抑制。在对拟南芥（Arabidopsis thaliana）根长的抑制作用中发现铝可通过细胞分裂素、生长素等信号途径参与到根的抑制作用中（Yang et al.，2017）;铝也会影响植株地上部分，多数植物类囊体和光合作用电子传递链会因铝的影响受损，使光合作用明显下降（Chen et al.， 2010）;铝还会造成ROS迸发（Huang et al.，2014），改变植物体内氧化还原状态。铝毒影响到植物的诸多方面，植物也对此做出应答，细胞程序性死亡是植物应对胁迫的防御机制，是生物体在适应环境及进行自身新陈代谢过程中正常的生理反应。在烟草（Panda et al.，2008）、拟南芥（Huo et al.，2018）、小麦（Yank et al.，2017）和花生（Arachis hypogaea）（詹洁等，2008）等植物中均发现铝胁迫会诱发PCD，引发基因水平、蛋白水平及代谢水平等的转变。

在植物应答胁迫过程中，信号的识别与传递至关重要。植物类受体蛋白激酶（receptor-like protein kinase， RLKs）在植物中普遍存在，在细胞信号转导途径过程中发挥重要作用，其中LRR型RLKs是植物中最大的类受体蛋白激酶家族，BAK1为其中研究较广泛的一员，在油菜素内酯信号途径（Russinova et al.，2004）、植物先天免疫（Wang et al.，2012）、细胞死亡（Kemmerling et al.，2007）等方面起作用。前人研究表明BAK1由胞外域（负责感知信号）、跨膜域（负责胞外信号传递至胞内）、胞内激酶域组成（负责将信号传递至下游），信号传递过程中磷酸化是BAK1激酶发挥作用的重要方式，特异位点磷酸化导致下游不同的调控作用（卫卓赟等和黎家，2017）。BAK1不是单独起作用，是与其他组分相互作用，BAK1/AtSERK3及其他同源物在调控细胞死亡起共同作用（He et al.，2007）;BAK1作为BR11（另一类富含亮氨酸重复序列的受体激酶）在BR信号通路中的共受体，共同调控生长发育（Tang et al.，2008）;植物BAK1可同时参加PTI和ETI两种先天免疫反应，不仅承担共受体的作用，也是免疫反应中许多效应蛋白的靶蛋白（Wang et al.，2012）。

花生是重要的油料作物，产油率高达40%，且富含蛋白质、脂肪、维生素及矿物质等营养成分。我国是世界花生生产、消费和出口大国，2013—2014年中国花生及花生仁出口达到13万t，金额达2亿美元（刘行等，2017）。花生不仅营养价值高，而且具有广阔的市场前景。在我国多个省份种植历史悠久，北方省份种植花生，以榨油为主，南方以鲜食、加工为主。花生的种植条件以雨水适中的沙土为主，但是南方土壤较多呈酸性土，富含游离铝，对花生会造成部分毒害，故目前铝毒机制在花生中的研究受到广泛关注。BAK1参与诱导与植物超敏反应有关的PCD过程，在植物的先天免疫响应中发挥核心作用，是否在铝诱导PCD信号事件中同样存在类似于植物先天免疫响应过程中的信号转导模式，其在铝诱导花生PCD过程中的作用尚不清楚。为此，本研究克隆得到AhBAK1完整开放阅读框，对AhBAK1蛋白进行了生物信息学分析，探究不同铝处理时间下的AhBAK1表达模式，并通过原核表达系统获得了AhBAK1的胞内域纯化蛋白，为发掘AhBAK1在花生铝处理下的调控机制奠定基础。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物、菌株和载体 供试材料是实验室早期筛选得到并保存的铝敏感花生品种‘中花2号（‘ZH2）和铝耐受性花生品种‘99-1507。菌株Escherichia coli DH5α，Rosetta为实验室以甘油管形式于-80 ℃保存，感受态细胞自行制备保存;原核表达载体pGEX-6p-1为本实验室保存，pMD19-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.2 酶和试剂 RT-PCR反转录酶均购自Promega公司;TB Green Premix Ex Taq II，dNTP、限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ购自宝生物工程（大连）有限公司;高保真酶、非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒（ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit）购自南京诺唯赞生物科技有限公司;抗GST标签鼠单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG（H+L）购自康为世纪生物科技有限公司;还原型谷腕甘肽购自生工生物工程有限公司、氨苄霉素、氯霉素购自北京Solarbio公司;蛋白纯化的亲和层析材料购自GE Healthcare公司;DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生化试剂公司。

1.2 实验方法

1.2.1 花生总RNA的提取和cDNA第一链的合成 RNA提取及cDNA的合成参照Liu et al.（2010）的方法进行。

1.2.2 AhBAK1基因克隆 以‘ZH2cDNA为模板，参照Takara LA酶说明书设置PCR体系和程序，以下列引物AhBAK1-F：ATGAGAATGAGGTTCTTTTG AhBAK1-R： TCTAGGACCAGAGAGTTCATC扩增目的片段，挑选含目的片段的菌液进行测序验证，并将测序验证结果正确的菌液保存于-80 ℃。

1.2.3 AhBAK1基因的生物信息学分析 在克隆得到AhBAK1基因完整开放阅读框的前提下，利用在线软件ExPASY （https：//web.expasy.org/compute_pi/）对AhBAK1蛋白进行蛋白分子量及等电点的预测;通过TMHMM2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分别预测蛋白的跨膜结构和疏水性;利用Signal4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在线预测蛋白的信号肽有无，利用PSORT II（https：//wolfpsort.hgc.jp/）对AhBAK1进行了亚细胞定位分析，SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa sopma.html）在线预测蛋白质的二级结构，利用SWISS-MOEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）在线软件预测获得AhBAK1蛋白三级结构，利用MEGA5.0软件进行多序列比对构建系统进化树;利用NCBI-BLAST （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行AhBAK1蛋白激酶域的分析。

本文中提到的基因或蛋白质的序列信息可在拟南芥数据库（Arabidopsis Information Resource）或基因数据库（GenBank/EMBL）中利用如下登记号找到：AhBAK1（XM_025783786.1），AtBAK1（NM_001203975）， BrLRRII5（JX073086）， GhBAK1（NM_001326866）， LjBAK1（KY131980），NaBAK1（XM_019377066）， OsBAK1（KT669690）。

1.2.4 AhBAK1基因在Al处理下的表达特性 以UBQ10R为内标基因，用实时荧光定量PCR分析AhBAK1基因在不同Al处理时间（0、4、8、12、24 h）下的相对表达水平，前期材料培养参考詹洁等（2008） 的方法，略有改动;反应体系及程序参考TB Green Premix Ex Taq II产品说明，实验做3次生物学重复，检测引物于NCBI-Primer BLAST设计，序列如表1所示。

1.2.5 AhBAK1基因原核表达载体构建 为获得GST-AhBAK1-CD融合基因，以‘ZH2cDNA为模板，用引物AhBAK1-CD-EcoR I-F（CCCCTGGGATCCCCGGAATTCCGAAGAAGGAAACGTGCTGATT）和AhBAK1-CD-Xho I-R（GTCACGATGCGGCCGCTCGAGTCTAGGACCAGAGAGTTCATCTGCT）扩增目的片段，将PCR产物纯化回收，参照ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit试剂盒方法进行回收产物与酶切载体重组反应，热激法转化重组产物至DH5α感受态，挑选阳性克隆进行测序验证，将测序正确的阳性克隆体质粒转化至表达菌株Rosetta，并以甘油管的形式保存于-80 ℃冰箱。

1.2.6 目的蛋白的表达和纯化

1.2.6.1 诱导表达 将含有pGEX-6p-1-AhBAK1-CD质粒的冻存Rosetta（DE3）菌株进行活化，挑选单克隆于5 mL含抗生素（Amp 100 μg·mL-1，Chl 100 μg·mL-1） LB液体中;待菌液浑浊后，按照V（菌液）∶V（LB液体）=1∶100的比例加入至200 mL LB液体（Amp 100 μg·mL-1，Chl 100 μg·mL-1）中，37 ℃，220 r·min-1培养3～4 h，待OD600=0.5～0.8，取2 mL菌液作为未诱导样品，于 8 000 r·min-1在4 ℃离心10 min保存沉淀待检测。其余菌液加入IPTG使其终浓度为0.1 mmol·L-1，于16 ℃，100 r·min-1条件下培养15～16 h，取2 mL菌液作为诱导后总蛋白对照离心待检测。剩余的菌液于8 000 r·min-1在4 ℃离心10 min，去上清液，按V（菌液）∶V（10 mmol·L-1 PBS）=10∶1加入PBS溶解沉淀，液氮速冻后加入PMSF使其终浓度为1 mmol·L-1，重悬菌液进行超声破碎10 min（超声5 s，停5 s，功率30%），破碎结束后 8 000 r·min-1，4 ℃离心10 min，分离上清和沉淀，沉淀用10 mmol·L-1 PBS（过滤除菌）重悬，取未诱导和诱导后总蛋白的沉淀重悬液，与超声后上清、沉淀重悬液各25 μL，分别加入75 μL 4×loading buffer，涡旋混匀，于100 ℃，变性10 min，取变性后蛋白进行12% SDS-PAGE电泳，分析蛋白是否被诱导表达。

1.2.6.2 蛋白纯化 参考GE公司Glutathione Sepharose 4B填料说明手册将诱导超声后的蛋白上清液进行纯化，并用SDS-PAGE电泳分析蛋白纯化效果。

2 结果与分析

2.1 AhBAK1基因在不同铝处理时间表达分析

在对铝处理下花生根尖转录组数据的分析中，我们发现了一个预测编码BAK1蛋白的基因（AhBAK1）受铝胁迫诱导上调。基于实时荧光定量PCR技术，我们对AhBAK1分别在花生品种‘ZH2（铝敏感型）和‘99-1507（铝耐受型）中铝处理下的表达模式进行了分析。如图1所示，在100 μmmol·L-1铝胁迫条件下，两品种根尖AhBAK1基因的表达模式不同。铝处理4 h时，‘ZH2根尖AhBAK1基因的表达与对照有显著差异，明显升高;随着铝处理时间的延长，AhBAK1基因表达量会降低，但仍高于对照;铝处理24 h后表达量又有所上升。铝处理4、8、12 h均显著提高了‘99-1507根尖AhBAK1基因的表达水平，但随后基因表达下降，至铝胁迫处理24 h时表达量会降低，但仍高于对照。

2.2 AhBAK1基因克隆

首先，将扩增产物与pMD19-T连接并转化至DH5α感受态细胞，然后进行PCR验证，结果见图2。从图2可以看出，在约 2 000 bp处出现特异性条带，与目的基因大小相符，将含目的片段的阳性菌株进行测序验证，结果表明扩增的AhBAK1基因序列與蔓花生（Arachis duranensis）的同源性高达100%。

将克隆得到的核酸序列翻译得到氨基酸序列，与部分已报道物种的BAK1氨基酸序列进行比对。结果发现，比对物种的BAK1序列在342～613 aa（STK_BAK1结构域）之间保持高度一致，且在LRR区（64～230 aa）也较一致，鉴于克隆得到的AhBAK1序列含有STK_BAK1_结构域保守的活性位点和富亮氨酸区域，故属于花生BAK1家族（图3）。

2.3 AhBAK1基因的生物信息学分析

2.3.1 AhBAK1蛋白理化性质分析 AhBAK1基因序列完整开放阅读框大小为 1 878 bp，编码625个氨基酸。ExPASy在线预测AhBAK1蛋白分子量大小为69.10 kD，等电点为5.91，化学分子式为C3055H4860N842O918S32，正电荷残基数为64，负电荷残基数为72，亮氨酸含量最高（占比13.1%），色氨酸含量最低（占比1.3%），不稳定系数为37.11%，指数较低为稳定蛋白，半衰期为30 h，预测得到蛋白质的平均亲水系数是 -0.192，故此蛋白为疏水蛋白。

2.3.2 AhBAK1跨膜结构与疏水性预测 TMHMM2.0可在线预测蛋白是否存在跨膜结构，结果见图4。从图4可以看出，AhBAK1为跨膜蛋白，跨膜区域氨基酸起始于13 aa，终止于30 aa，但据预测结果分析可知其可能是双跨膜蛋白，在200～300 aa之间也可能存在跨膜区域。

利用ProtScale在线软件预测AhBAK1蛋白的疏水性，结果分析表明在氨基酸序列的各位点预测分值均为正值，平均值大于0，表明AhBAK1为疏水蛋白（图5）。

2.3.3 AhBAK1蛋白信号肽与亚细胞定位分析 信号肽是蛋白质N端一段特异的氨基酸序列，辅助蛋白完成信号转导。Signal4.1预测表明AhBAK1蛋白序列中不存在信号肽，且通过PSORT II预测AhBAK1可能的定位，发现AhBAK1定位于细胞质膜的可能性最高，为71%，说明其编码的蛋白质很有可能定位在细胞质膜上发挥作用（图6）。

2.3.4 AhBAK1氨基酸序列比对与进化树构建 通过NCBI-BLAST分析获得部分物种与AhBAK1比较的氨基酸序列，并通过MEGA5.0构建进化树（图7）分析可知AhBAK1与大豆（Glycine max）和木豆（Cajanus cajan）等豆类的亲缘关系较近，而与拟南芥及野大豆（Glycine soja）的亲缘关系较远。通过DNAMAN序列比对分析可知多个富亮氨酸重复区域序列以及激酶域序列在各物种中相对保守，不保守区域主要集中在序列的N端区域，可能与部分差异功能执行有关。

2.3.5 AhBAK1蛋白结构和结构域分析预测 用SOPMA在线预测AhBAK1蛋白二级结构，结果表明AhBAK1蛋白质二级结构主要由α螺旋（41.60%）、无规则卷曲（40.64%）和延伸链（13.76%）组成，且在NCBI网站工具中分析氨基酸序列发现AhBAK1蛋白含有蛋白激酶家族PKc-like 保守结构域以及富亮氨酸激酶保守结构域PLN00113或PLN0011（图8）。

预测获得的AhBAK1蛋白三级结构（图9）与二级结构结果相符合，主要是由α螺旋、无规则卷曲和延伸链进一步折叠组装形成三级结构，且与拟南芥BAK1预测得到的其中一个三级结构符合，进一步证明AhBAK1属BAK1家族。

2.4 AhBAK1基因原核表达载体构建

为了获得可溶性重组蛋白，本研究基于TMHMM2.0预测蛋白跨膜域以及AhBAK1蛋白激酶域预测的基础（图10），尽可能规避了跨膜区域的疏水氨基酸残基，选择预测的胞内域中包括完整BAK1激酶域的787～1 875 bp做后续原核表达研究。采用同源克隆的方法，获得阳性菌株（图11）并进行测序。经测序比对，获得pGEX-6p-1-AhBAK1-CD重组表达质粒。

2.5 重组蛋白的诱导与纯化

2.5.1 重组蛋白的诱导 诱导表达后取变性蛋白SDS-PAGE检测，结果如图12。从图12可知，在4个不同IPTG浓度诱导下， 在70～100 kD之间均利用DNAMAN软件对AhBAK1氨基酸序列与拟南芥（AtBAK1; AT4G33430）、油菜（BrLRRII5; AFO67895.1）、棉花（GhBAK1; NP_001313795.1）、日本百脉根（LjBAK1; ATV94829.1）、烟草（NaBAK1; XP_019232611.1）和水稻（OsBAK1; AJK31513.1）同源蛋白进行序列比对，箭头代表BAK1同源蛋白的特征保守活性位点。

出现特异性条带，与生物信息学预测的加了标签（GST）的蛋白分子量一致。

2.5.2 重组蛋白的纯化与鉴定 AhBAK1-CD重组蛋白经凝胶親和层析结果见图13、图14。结果表明，在70～100 kD之间均出现单一目的条带，表明AhBAK1-CD重组蛋白纯化成功，且经Western Blot特异性抗体检测发现有GST标签的特异性条带，此纯化蛋白可用于后续研究（图13，图14）。

3 讨论

BAK1在油菜素内酯（BR）信号转导、细胞死亡调控及抗菌方面发挥关键作用（卫卓赟和黎家，2017）。前人研究发现，拟南芥BAK1突变体表现为对病原菌过敏感，先天免疫响应大大削弱，而提高BAK1的转录水平能减少坏死，抑制PCD的发生，表明BAK1具有负调控植物PCD的功能（Chinchilla et al.，2007;Kemmerling et al.，2007）。FLS2与BAK1在FLG22刺激后相互作用形成复合体，之后被激活的BAK1继续磷酸化BIK1;BIK1是BAK1下游免疫信号的中枢，是多条免疫信号的重要节点，后续的研究发现BIK1能直接催化质膜蛋白NADPH氧化酶RbohD发生磷酸化，增强胞内ROS水平（Lu et al.，2009;Lei et al. ，2014）。这些结果显示，类受体蛋白激酶BAK1在先天免疫响应的信号传导中起了核心作用。在本研究中，我们发现花生AhBAK1转录水平在未做铝处理的花生根尖表达量较低，但在铝处理条件下其转录水平迅速上调，且在检测的两个花生品种间存在差异。尽管AhBAK1在‘ZH2和‘99-1507中对铝胁迫有着迅速（4 h）的响应，但在‘99-1507中AhBAK1基因的表达量明显要高于‘ZH2。詹洁等（2008）研究证明‘99-1507是耐铝品种，‘ZH2是铝敏感品种，这种差异暗示了AhBAK1对增强铝耐受性的正向作用。

克隆花生AhBAK1基因，并获得编码其激酶域的重组蛋白，是研究AhBAK1的生物学功能和生化功能的前提条件。本研究中，我们获得了AhBAK1基因编码区全长序列，氨基酸序列分析表明AhBAK1具有和拟南芥、油菜、水稻、烟草等已鉴定的BAK1一致的特征保守活性位点;蛋白质高级结构预测分析表明，尽管在亲缘关系上AhBAK1和AtBAK1相距较远，但二者有着高度相似的三维结构，这些结果显示AhBAK1具有和AtBAK1相似的功能。

生物信息学分析预测AhBAK1是一个膜定位蛋白;为了获得可溶性的重组蛋白以检测AhBAK1可能的激酶活性，本研究选择避开跨膜区域的疏水氨基酸残基，构建了含有预测为激酶域序列的重组质粒pGEX6p-1-AhBAK1-CD。由于重组蛋白的原核表达主要受温度、IPTG浓度和诱导时间的影响（李晶等，2017），本研究结果发现在37 ℃和18 ℃条件下，0.5 mmol·L-1 IPTG不能诱导表达AhBAK1-CD重组蛋白;在16 ℃条件下，在不同IPTG浓度诱导下，AhBAK1-CD均可成功表达，说明温度是诱导表达AhBAK1-CD的关键。

4 结论

本研究揭示了AhBAK1响应花生铝胁迫上调表达，且在铝耐受型花生品种中具有更强、更快速的上调反应特点，暗示着该基因与花生抗铝过程的正向关系。通过原核表达分析，本研究获得了编码AhBAK1激酶域的胞内域蛋白片段，为后续开展AhBAK1蛋白相关生化功能研究奠定了基础，为研究花生铝胁迫诱导PCD的分子机制提供了新的思路。

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（责任编辑 何永艳）