多裂骆驼蓬叶片转录组分析

夏铭泽 张雨 余静雅 张发起

摘 要： 多裂骆驼蓬为西北荒漠地区常见植物，具有抗风固沙、防止水土流失、抑菌杀虫和抗肿瘤等功效。为了增加骆驼蓬属植物开发利用的强度，弥补其基因功能、代谢通路等分子生物学研究层面的空缺，该文利用Illumina高通量测序平台对多裂骆驼蓬叶片进行转录组测序，根据测序结果进行转录组数据拼接、功能注释、序列水平和表达水平等分析。结果表明：共获得7 723 653 900 bp核苷酸序列信息，拼接组装得到78 641条Unigene，预测出55 535条CDS序列。与多个数据库对比后，获得33 184个NR数据库注释信息;31 835个GO数据库注释信息;17 206个KOG数据库Unigene功能分类信息;7 617个KEGG数据库代谢通路注释信息。对单核苷酸多态性位点和微卫星信息进行检测分析，共发现86 113个SNP位点，6 987个SSR信息。该研究首次获得并分析了多裂骆驼蓬的转录组数据，通过基因比对、CDS预测、通路注释、SNP检测和SSR检测等方法，对该植物的基因、通路以及分子标记等方面有了初步的认识，为本种植物后续研究及资源的开发利用奠定了基础。

关键词： 多裂骆驼蓬， 转录组分析， 基因注释， SNP， SSR

中图分类号： Q943

文献标识码： A

文章编号： 1000-3142（2021）04-0503-11

Abstract： Peganum multisectum is a common plant in arid-desert areas of Northwest China， which has the effects of resisting wind and sand fixation， preventing soil erosion， inhibiting bacteria and insects， and resisting tumor. But the lack of molecular biology research on this plant， such as gene function and metabolic pathway， leads to its underutilization. Here in this study， the transcriptomes of P. multisectum leaves were sequenced by the platform of Illumina. According to the sequencing results， we analyzed splicing， functional annotation， sequence level and expression level of the transcriptome data. Then we obtained a total of 7 723 653 900 bp nucleotide sequence information， assembled 78 641 Unigene sequences and predicted 55 535 CDS sequences. After comparing with several databases， 33 184 NR database annotation information， 31 835 GO database annotation information， 17 206 KOG database Unigene functional classification information and 7 617 KEGG database metabolic pathway annotation information were obtained. In addition， we detected a total of 86 113 single nucleotide polymorphism sites and 6 987 microsatellite information. In this study， transcriptome data of P. multisectum were obtained and analyzed for the first time. These analyses not only shed light on the molecular information of P. multisectum， but also provide a certain reference for the post research， development and utilization of this plant.

Key words：  Peganum multisectum， transcriptome analysis， gene annotation， SNP， SSR

1753年植物學家林奈（Carl Linnaeus）以骆驼蓬（Peganum harmala）为模式种建立了骆驼蓬属（Peganum L.）（徐朗然和黄成就，1993）。该属在《中国植物志》中属于蒺藜科（Zygophyllaceae）（徐朗然和黄成就，1993），在Flora of China中属于骆驼蓬科（Peganaceae），在APG Ⅳ系统中属于白刺科（Nitrariaceae）骆驼蓬亚科（Subfam. Peganoideae Engl.）（Angiosperm Phylogeny Group et al.，2016）。骆驼蓬属植物为多年生草本，全世界共6种，中国有3种，即骆驼蒿（Peganum nigellastrum）、骆驼蓬（P. harmala）和多裂骆驼蓬（P. multisectum），主要分布于新疆、宁夏、青海、甘肃和内蒙古的荒漠或半荒漠地区（徐朗然和黄成就，1993）。多裂骆驼蓬是中国特有种（段金廒等，1998），该植物对各种生境的适应力强于骆驼蒿和骆驼蓬（刘媖心，1995），具有旱生植物的典型特征，如根系发达，叶片深裂且裂片较细，有较强的耐旱特性。此外，多裂骆驼蓬植物体生长繁茂，在改善西北荒漠环境中发挥着抗风固沙和防止水土流失的重要作用（马骥和王勋陵，1998;程琳等，2018）。该种资源丰富，仅甘肃省年产量超过1亿Kg（樊峥嵘和姚新生，1992）。近年来的研究表明，骆驼蓬属植物具有抑菌杀虫（薛林贵等，2005）、抗肿瘤（陈豫等，2015）等多种药理学活性;提取物和生物碱对多种植物种子的萌发有抑制作用（刘建新，2003;刘建新等，2008）。段金廒等（1998）从多裂骆驼蓬中分离并鉴定了22种化合物，刘建新等（2011）研究显示外源一氧化氮可以保护盐胁迫下多裂骆驼蓬幼苗的光合系统。目前，对多裂骆驼蓬的研究主要集中在药理活性、种子萌发及幼苗生长方面。已报道的分子序列仅见于Zhao等（2011）利用trnL-F片段和psbA-trnH片段对骆驼蓬属植物的鉴定，基因注释信息亦不完善，阻滞了与药物活性成分合成相关的代谢通路的研究。因此，亟需利用基因组或转录组数据来拓展分子生物学信息。

转录组（transcriptome）是指生物体的细胞或组织在特定时空条件下转录出的RNA的总和（张春兰等，2012）。较基因组而言，转录组仅涉及被转录的基因，可以更有效地针对功能基因及其代谢通路进行研究（周华等，2012）。随着近年来高通量测序技术的发展，其测序时间和测序成本大大降低（Shendure & Ji，2008），越来越多的学者将高通量测序技术应用到转录组研究中，从而获得来自不同基因的海量RNA序列数据。如叶兴状等（2019）对濒危珍稀植物半枫荷（Semiliquidambar cathayensis）进行转录组分析，发现了控制药效合成的转录因子家族;Zhang et al.（2014）对青藏高原特有植物唐古红景天（Rhodiola tangutica）植物进行比较转录组分析，为解释该植物可用于预防高原反应的机制提供了分子水平的依据;李彦等（2018）分析了山地虎耳草（Saxifraga sinomontana）的转录组微卫星位点信息，为该物种遗传多样性研究提供了理论依据;付苏宏等（2019）研究了菊叶香藜（Dysphania schraderilana）转录组数据库中的FPPS基因，对该植物倍半萜类化合物的生物合成奠定了基础。目前，已有部分具药用价值的植物完成转录组测序工作，如人参（Panax ginseny）（邹丽秋等，2016）、三七（P. notoginseng）（黄勋等，2017）、甘草（Glycyrrhiza uralensis）（张春荣等，2015）、乌头（Aconitum carmichaelii）（张大燕等，2017）和金铁锁（Psammosilene tunicoides）（孟文俊，2019）等，为进一步研究药用植物的功能基因及代谢通路提供了分子基础。

骆驼蓬属植物资源丰富，为增加本属植物开发利用的强度，应对其基因功能、代谢通路等进行深入研究。因此，本文选取多裂骆驼蓬叶片为研究材料，利用Illumina Hiseq 2500高通量测序平台对其进行首次转录组测序，建立该物种转录组数据库，通过生物信息学方法对Unigene进行功能注释、代谢途径及SSR检测等分析，挖掘多裂骆驼蓬具有药效和抗干旱作用的功能基因，为进一步研究该植物代谢通路和遗传多样性奠定基础，也为今后本属植物的开发利用和保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

多裂骆驼蓬植株采自青海省共和县铁盖乡（36°06′56.61″ N、100°41′41.74″ E， 2 594 m）。将采集的成熟植物叶片放入液氮中快速冷冻，返回实验室后放入-80 ℃超低温冰箱保存。凭证标本（Zhang2018013）存放在中国科学院西北高原生物研究所青藏高原生物标本馆（HNWP）中。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 从多裂骆驼蓬的叶片材料中提取总RNA，用琼脂糖凝胶电泳分析RNA的降解程度以及是否有污染;用Nanodrop 2000初步检测RNA的纯度（A260/A280应在1.9～2.0范围内）;使用Agilent 2100测定样品的RIN值以确定RNA完整性。

1.2.2 拼接组装 利用Illumina Hiseq 2500高通量测序平台进行测序，得到的原始图像数据由CASAVA碱基识别（base calling）后轉化为原始测序数据（Raw reads）。该数据文件包含测序得到的碱基序列（reads）信息及其对应的碱基测序质量信息。质量评估后对所得的原始测序数据进行过滤：去除接头（adapter）序列;去除含有未知碱基的序列;从序列两端起始，去除低质量的碱基。过滤后的测序数据为Clean reads，使用软件Trinity（Grabherr et al.，2011）（版本为2.4.0;参数设置为min_kmer_cov=2，其余为默认设置）将该数据组装成转录本，并取每条基因中最长的转录本作为Unigene，以此作为后续分析的参考序列。

1.2.3 功能注释 使用NCBI BLAST+（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）将Unigene序列与CDD、KOG、COG、NR、NT、PFAM、Swissprot和TrEMBL数据库比对，获得基因的功能注释信息。首先根据Swissprot数据库和TrEMBL数据库的蛋白注释结果，结合Uniprot（UniProt，2018）的注释信息得到GO注释。使用软件KAAS（KEGG Automatic Annotation Server）（Moriya，2007）将Unigene序列与KEGG基因数据库进行BLAST或GHOST比较，以此来获得基因的功能注释信息。首先根据NR、Swissprot、TrEMBL的最佳比对结果按其优先级顺序确定Unigene的ORF读码框;然后根据标准密码子表确定其CDS序列（Coding Sequence，氨基酸序列），同时将未比对上的Unigene通过TransDecoder软件预测其CDS序列。

1.2.4 SNP和SSR的筛选与统计 以组装好的Unigene作为参考序列，使用BCFtools（版本为2.4.3）（Quinlan，2010）找出其中的SNP位点，参数为质量值大于20且覆盖度大于8，对筛选出的SNP突变类型进行统计分析。使用MISA（版本为1.0.1）（Thiel，2003）检测Unigene序列中的SSR信息，检测的类型包括完美型（perfect）及复合型（compound）的SSR。微卫星各重复单元的筛选标准为二核苷酸SSR至少重复6次，三核苷酸SSR至少重复5次，四核苷酸至少重复5次，五核苷酸至少重复5次，六核苷酸至少重复5次。使用Excle（版本为Microsoft Office 2016）软件对SSR的类型、数量等进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 转录组数据组装及Unigene获取

对多裂骆驼蓬叶片mRNA进行测序，共获得51 491 026条Raw reads，包含7 723 653 900 bp的核苷酸序列信息，平均每条read的长度为150 bp，长度大于30 bp序列的占比为93.76%，GC百分比为47.65%。对Raw reads进行过滤，获得50 104 364条Clean reads，包含7 257 449 296 bp的核苷酸序列信息，平均每条read的长度为144.85 bp，长度大于30 bp序列的占比为95.06%，GC百分比为47.46%。

用Trinity软件对Clean reads进行de novo组装后获得148 317个Transcript，去冗余后获得78 641条Unigene，其总的核苷酸数分别为117 421 439、52 289 971个（表1）。Unigene长度在200～300 nt之间的有31 316条，占比39.82%;在300～2 000 nt之间的有42 524条，占比54.07%;长度超过2 000 nt的有4 801条，占比6.10%（图1：A）。同时，对多裂骆驼蓬Unigene的编码序列进行预测，共获得55 535条CDS序列。CDS序列长度在100～200 nt之间的有12 541条，占比22.58%;在200～300 nt之间的有15 311条，占比27.57%;在300～2 000 nt之间的有 26 416 条，占比47.57%;长度超过2 000 nt的有1 267条，占比2.28%（图1：B）。

2.2 转录组基因功能注释

将Unigene分别与CDD、KOG、NR、NT、PFAM、Swissprot、 TrEMBL、 GO和KEGG数据库进行比对并注释基因功能（表2）。其中，注释到NR数据库、TrEMBL数据库和GO数据库的基因数目最多，分别有33 184、32 887、31 835个，占总基因数目的42.2%、41.82%、40.48%;注释到KEGG数据库的基因数目最少，为3 875个，仅占总基因数目的2.97%。总体而言，共有38 598个Unigene基因经过多数据库比对后成功注释，仍有40 043个Unigene基因未能获取注释信息。

2.3 NR数据库Unigene近似物种比对

将Unigene与NR数据库进行比对，结果显示有33 184个Unigene获得注释信息，占Unigene总数的42.2%。通过与NR库的比对，揭示了多裂骆驼蓬转录组序列与库中物种的近似情况，结果显示该物种与甜橙（Citrus sinensis）的相似序列最多，有7 078条，占NR库注释的Unigene总数的21.33%;其次为克莱门柚（C. clementina），有4 827条，占NR库注释的Unigene总数的14.55%。此外，部分物种还与多裂骆驼蓬有大量基因序列相类似，如可可（Theobroma cacao）、葡萄（Vitis vinifera）、麻疯树（Jatropha curcas）、蓖麻（Ricinus communis）、 枣（Ziziphus jujuba）、 毛果杨 （Populus trichocarpa）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）和大麦（Hordeum vulgare），这些物种与多裂骆驼蓬相似的基因序列共有7 218条，共占NR库注释的Unigene总数的21.75%。其余42.37%的注释Unigene分布于其他561个物种中（图2）。

2.4 Gene Ontology数据库Unigene功能分析

在GO数据库中比对骆驼蓬转录组Unigene，有31 835条Unigene获得210 748条注释信息。所有注释信息分为三大类，即生物学过程（biological process）、细胞组分（cellular component）和分子功能（molecular function）。所有大类可细分为67个二级分类。对Unigene在二级分类中的分布情况进行统计分析，结果显示细胞（cell）和细胞部分（cell part）类型的Unigene最多，分别为23 443、23 399个，分别占GO注释信息总数的73.64%、73.50%。此外，细胞过程（cellular process）、连接（binding）、细胞器（organelle）、代謝过程（metabolic process）和细胞膜（membrane）类型的Unigene也较多，分别有21 154（66.45%）、18 776（58.98%）、18 689（58.71%）、18 477（58.04%）和10 999（34.55%）条注释信息。化学引诱剂活性（chemoattractant activity）、生物相（biological phase）和形态发生素（morphogen activity）类型的注释信息较少（图3）。

2.5 KOG数据库Unigene功能分类

在KOG数据库中比对骆驼蓬转录组Unigene，结果显示共17 206条Unigene获得注释信息，被分为25类（图4）。其中，一般功能预测基因（general function prediction only）、翻译后修饰、蛋白质折叠和分子伴侣（posttranslational modification， protein turnover， chaperones）、信号传导机制（signal transduction mechanisms）获得注释最多，分别有2 179、2 049和1 871条。细胞活性（cell motility）获得注释最少，仅6条（图4）。

2.6 KEGG数据库Unigene代谢通路分析

使用KEGG数据库对Unigene序列进行比对注释，代谢通路分析结果显示多裂骆驼蓬转录组中共有3 875个Unigene获得7 617条代谢通路注释信息。这些通路信息可分为四大类，分别为细胞进程（cellular processes）、环境信息处理（environmental information processing）、遗传信息处理（genetic information processing）和新陈代谢（metabolism）。这四大类可进一步分为23个小类（图5）。其中，翻译（translation）和信号传导（signal transduction）获得注释信息最多，分别有662条和590条;信号分子和相互作用（signaling molecules and interaction）及膜运输（membrane transport）的注释最少，有2条和21条。

所有注释的代谢通路信息中，共有240个Unigene与药物活性成分合成相关。其中，51个Unigene参与了萜类骨架生物合成通路（KEGG数据库通路ID：ko00900），5个Unigene参与了单萜类生物合成通路（KEGG数据库通路ID：ko00902），9个Unigene参与了二萜类生物合成通路（KEGG数据库通路ID：ko00904），9个Unigene参与了倍半萜类和三萜类生物合成通路（KEGG数据库通路ID：ko00909），这些通路均与萜类物质合成相关。有62个Unigene参与了苯丙烷类生物合成通路（KEGG数据库通路ID：ko00940），这与苯丙素类物质合成相关。此外，还有13个Unigene参与了黄酮类生物合成通路（KEGG数据库通路ID：ko00941），16个Unigene参与了易喹啉生物碱生物合成通路（KEGG数据库通路ID：ko00950），31个Unigene参与了泛醌和其他萜类醌生物合成通路（KEGG数据库通路ID：ko00130），19個Unigene参与了花生四烯酸类生物合成通路（KEGG数据库通路ID：ko00590）。

多裂骆驼蓬在干旱生境下仍有较强的适应力（刘媖心，1995）。通过转录组数据分析发现，多裂骆驼蓬叶片转录信息包含有多个脱落酸（abscisic acid， ABA）合成相关基因，即ZEP（zeaxanthin epoxidase）基因、AAO3（abscisic-aldehyde oxidase）基因和PYL（abscisic acid receptor）基因。此外，还有茉莉酸 （jasmonic acid， JA）合成相关基因，即LOX（lipoxygenase）基因、TGA（transcription factor）基因、JAR1（jasmonic acid-amino synthetase）基因、AOS（hydroperoxide dehydratase）基因和MYC2（transcription factor）基因。已有研究表明，脱落酸和茉莉酸的合成可以增加植物的抗逆能力（张春荣等，2015）。

2.7 多裂骆驼蓬Unigene序列单核苷酸多态性检测分析

对多裂骆驼蓬Unigene序列进行检测，共发现86 113个单核苷酸多态性（SNP，single nucleotide polymorphsims）位点。对这些SNP位点进行类型统计，结果显示转换突变类型的SNP有58 486个（占67.92%），颠换突变类型的SNP有27 627个（占32.08%）。在转换突变类型中，由鸟嘌呤转换为腺嘌呤的突变最多（15 042个），其次为胞嘧啶转换为胸腺嘧啶的突变（15 000个），表明G→A和C→T二者发生频率相差不大。在颠换突变类型中，由腺嘌呤颠换为胸腺嘧啶的突变最多（4 136个），而鸟嘌呤颠换为胞嘧啶的突变最少（2 700个）（图6）。

2.8 多裂骆驼蓬Unigene序列微卫星信息分析

利用软件MISA对多裂骆驼蓬Unigene进行微卫星位点（SSR，simple sequence repeat）进行检测，共检测出3 399个SSR。对SSR类型进行统计，结果显示复合型（compound）SSR和完美型（perfect）SSR分别有442个和2 957个，其发生频率为4.32%（检测出的SSR数量与总序列数目的比值）。从分布情况来看，多裂骆驼蓬转录组序列中平均每15.38 kb（序列总长度与SSR总数目的比值）出现一个SSR，表明该物种转录组SSR数量较为丰富。在完全型SSR中，三核苷酸重复占45.01%;二核苷酸重复次之，占38.22%;四核苷酸重复、五核苷酸重复和六核苷酸重复分别占2.53%、0.65%和0.59%。

3 讨论与结论

多裂骆驼蓬是西北荒漠地区的常见植物，因其根系发达，具有良好的水土保持作用（马骥和王勋陵，1998），且该植物作为维族、蒙古族和藏族的常用草药（徐小平等，2008;李凯等，2015）已有长久的历史。多裂骆驼蓬在西北地区资源量巨大，为了合理有效地利用这一植物资源，我们通过转录组测序的手段以获取其序列信息及基因表达特征。

本研究通过对多裂骆驼蓬叶片进行转录组测序，共获得了51 491 026条Raw reads和50 104 364条Clean reads。拼接组装得到78 641条Unigene，N50长度为1 154，平均长度为664.92 bp，比半枫荷（叶兴状等，2019）、胡卢巴（Trigonella foenum-graecum）（Patel et al.，2014）、川芎（Ligusticum chuanxiong）（袁灿等，2017）、狼毒（Stellera chamaejasme）（杨艳芳等，2017）和东北红豆杉（Taxus cuspidata）（吴琼等，2012）Unigene的平均长度更长，说明本研究拼接所得长序列Unigene较多，并对Unigene的编码序列进行预测，共获得55 535条CDS序列。所得长序列Unigene的增多可能与测序物种的差异有关。

将Unigene序列与CDD、KOG、COG、NR、NT、PFAM、Swissprot、TrEMBL、GO和KEGG共10个数据库比对，共有38 598条（49.08%）序列经过多数据库比对后成功注释，但仍有40 043条（50.92%）未得到准确定位，这一现象在许多物种的转录组结果中均有出现，如樟树（Cinnamomum camphora）（江香梅等，2014）、黄秋葵（Abelmoschus esculentus）（Schafleitner et al.，2013）和紫背天葵（Begonia fimbristipula）（张少平等，2016）。这可能与某些Unigene片段长度太短、相关数据库基因注释信息不完善或者该物种存在新基因等因素有关。通过与NR库的比对，显示多裂骆驼蓬与甜橙、克莱门柚、可可和葡萄等物种具有大量相似基因序列。多裂骆驼蓬与四个同科植物仅有14条相似基因序列，分别为白刺（Nitraria tangutorum）7條、N. retusa 4条、骆驼蓬2条和小果白刺（N. sibirica）1条，或与白刺科植物基因组、转录组数据严重缺乏有关。通过比对GO数据库，获得31 835条Unigene的210 748个功能分类信息，通过比对KOG数据库，获得17 206个Unigene注释信息，因此对多裂骆驼蓬Unigene的功能分布状况有了初步的了解。此外，对拼接组装的78 641条Unigene进行代谢通路分析，通过比对KEGG数据库最终获得3 875条（4.93%）Unigene的7 617条代谢通路注释信息，注释类别可分为四大类，其中定位到新陈代谢相关通路的基因数最多，占总注释量的47.15%，表明多裂骆驼蓬代谢活动能力较强，之后这四大类可细分为23个小类，其中翻译和信号传导获得注释信息最多。将注释基因映射到药物合成相关通路，发现有240个Unigene与药物合成通路相关，参与合成的次生代谢产物类型有萜类、苯丙素类、黄酮类、生物碱类等，这为后续多裂骆驼蓬药用活性成分的研究提供了基础数据。此外，在多裂骆驼蓬转录组中还发现多个脱落酸和茉莉酸的合成相关基因，甘草（张春荣等，2015）的干旱胁迫研究表明此类基因与抗干旱胁迫作用相关，推测此类基因与多裂骆驼蓬适应西北干旱环境的特性有关。

多裂骆驼蓬转录组SSR的发生频率为4.32%，与检索条件相同（即不包含单核苷酸SSR）的其他物种相比，高于马尾松（Pinus massoniana）（2.22%）（杜明凤和丁贵杰，2018）、冷蒿（Artemisia frigida）（2.61%）（岳春江等，2016）、杜仲（Eucommia ulmoides）（2.91%）（黄海燕等，2013）和杉木（Cunninghamia lanceolata）（3.16%）（吴夏雷等，2018），与红松（P. koraiensis）（4.24%）（张振等，2015）和灯盏花（Erigeron breviscapus）（4.79%）（陈茵等，2014）相差较小，明显低于半夏（Pinellia ternata）（16.24%）（王森等，2014）和刺梨（Rosa roxburghii）（20.37%）（鄢秀芹等，2015）。这种差异可能是与物种选择、组装方法或筛选软件的不同有关。此外，该物种转录组SSR的优势基元为三核苷酸重复，这与马尾松（杜明凤和丁贵杰，2018）、杉木（吴夏雷等，2018）、刺梨（鄢秀芹等，2015）等研究结果相一致。有研究表明，转录区的三核苷酸重复在面对自然选择时表现出积极响应的作用，且该基序是在编码区受到重大突变压力时而存在的一种丰富的核苷酸重复基序（李彦等，2018），即当植物表现出某些抗逆性时三核苷酸重复分布较为丰富，多裂骆驼蓬具有较强的耐干旱能力进一步证实了该结论。此外，我们推测，随着干旱环境的胁迫，该物种产生了相应的抵御和适应机制，并逐渐形成了丰富的三核苷酸重复结构。通过分析和挖掘多裂骆驼蓬转录组SSR信息，可为今后该物种SSR分子标记的开发及其遗传多样性研究提供生物信息学基础。

本研究首次获得了多裂骆驼蓬的转录组数据，通过生物信息学的方法对该数据进行分析，内容涵盖基因比对、CDS预测、通路注释、SNP检测和SSR检测，对该植物的基因、通路以及分子标记等方面有了初步的认识，弥补了本植物在分子数据方面的空缺，也进一步丰富了白刺科植物的转录组数据库，同时也为多裂骆驼蓬的物种分化研究、谱系地理学研究、遗传多样性研究和系统发育学研究提供了数据保障，为本种植物资源的开发利用奠定了基础。

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（责任编辑 蒋巧媛）