新型啤酒糟果醋营养成分变化

王丹，贺倩钰，马超，赵康云，汪部国，徐斌

吉林医药学院公共卫生学院（吉林 132013）

我国盛产啤酒，啤酒糟是啤酒工业的主要副产物，每生产1 t啤酒大致可以产生0.25 t的啤酒糟，我国啤酒糟年产量已经达1 000万 t以上，而且啤酒糟的产量还在不断增加[1]。啤酒糟中富含维生素、膳食纤维、矿物质以及蛋白质等营养物质，所以该如何利用高营养价值的啤酒糟成了研究人员一个共同的难题。

在国外，食品、医疗、发酵等行业逐渐大量应用啤酒糟。但是我们国家对啤酒糟的利用起步较迟，这主要是因为啤酒糟成分复杂、含水量高及运输和贮藏困难[2]，因此现在还处于把啤酒糟仅用做饲料的阶段，这样不仅浪费，而且没有将啤酒糟的潜在利用价值充分发挥出来[3]。苹果是一种广为人知的水果，其富含维生素C、黄酮、多酚等营养物质[4]。果醋是以新鲜水果或者其加工残渣为主要原料，利用现代生物技术酿造而制得的一种风味独特、功能丰富的饮品。果醋不但有美容保健的功能，还能降血糖，而且可以减少身体里堆积的碳酸水含量，起到消除疲劳、补充能量的作用。目前市场上所售的果醋大多是单一的水果所制成，如沙棘醋、蜜柑醋、甘蔗汁果醋[5-7]，营养功能单一，香气结构不突出，口感风味欠佳。

此次试验以啤酒糟和苹果为原料进行液态二次发酵，制得复合型啤酒糟果醋，对其发酵过程中纤维素、维生素C、粗脂肪、蛋白质、单宁、黄酮、多酚、五碳糖、矿物质9种营养物质进行研究分析，为人们选择新型复合型果醋提供更加直观的参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、醋酸杆菌（Acetobacterium balch）：山东烟台帝伯仕有限公司；蔗糖、柠檬酸、柠檬酸钠（食品级）；新鲜苹果（吉林本地市场市售）；啤酒糟（实验室保藏）；芦丁、单宁、福林酚试剂、木糖标准品（上海源叶生物科技有限公司）；标准抗坏血酸（标准品，酷尔化学科技有限公司）；没食子酸（标准品，上海金穗生物科技有限公司）；石油醚（分析纯，北京化工厂）；无水乙醇（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司，原天津市化学试剂六厂三分厂）；靛红、高锰酸钾、2, 4-二硝基苯肼、活性炭、盐酸、乙醚、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、乙醇、碳酸氢钠、浓硝酸（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）。

1.2 仪器与设备

多功能食品加工机（MODEJ：JX2118型，福州金雄电器有限公司）；电热恒温水浴锅（HHS-型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；电子天平（ES5000-1B型，沈阳亮衡天平仪器有限公司）；分析天平（JD-3型，沈阳龙腾电子有限公司）；玻璃仪器气流烘干机（C型，郑州科华仪器设备有限公司）；氮磷钙消化器（NPCa-02型，上海贝特仪电设备厂）；电热恒温干燥箱（202-1型，天津市泰斯特仪器有限公）司；原子吸收分光光度计（TAS-986型，北京普析通用仪器有限公司）；智能控热电热板（DB-2A型，常州朗越仪器制造有限公司）。

1.3 工艺流程

挑选新鲜苹果→清洗→切块去核→榨汁→调节酸糖含量→加啤酒糟→酒精发酵→醋酸发酵→离心→装瓶→杀菌

1) 苹果：取新鲜市售苹果与蒸馏水，按1∶1比例混合榨汁8 min。

2) 啤酒糟：取适量新鲜啤酒糟，在80 ℃下干燥5 h，打碎，用0.150 mm孔径筛过滤。

3) 酒精发酵：在酒精发酵前，先将酵母活化。在灭菌的5%蔗糖溶液中加入适量的干酵母，在37 ℃的水浴中活化30 min。酵母活化后，向苹果匀浆中加入0.6%的酵母活化液和1.5%的啤酒糟，发酵温度为28 ℃，用两层无菌纱布包扎的棉塞封口，发酵时间为7 d。

4) 醋酸发酵：醋酸发酵阶段由于试验使用的醋酸菌为需氧菌，需要进行振荡摇床培养，来提供所需氧。设置摇床转速120 r/min、发酵温度32 ℃。经酵母发酵7 d，直接在发酵液中接种1%已称量好的醋酸菌，放入调好参数的恒温振荡培养箱中继续培养11 d。

选择同一批苹果匀浆，酵母发酵7 d后的果酒和醋酸发酵11 d后的果醋，分别取样测定其中9种营养物质的含量（苹果匀浆可直接测定，果酒、果醋需分别在4 000 r/min条件下离心10 min，取其上清液分别装入清洗干净的小罐中，高压灭菌，用封口胶密封，在4 ℃下冷藏，测定时打开）。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 纤维素含量测定方法[8]

取0.1 g样品于试管中，加入5 mL硝酸-醋酸混合液，置沸水中水浴25 min，不断搅拌。取出试管后，冷却离心，用蒸馏水洗涤沉淀3次，向其中加入10 mL 10%硫酸和10 mL 0.01 mol/L的重铬酸钾溶液，水浴于沸水中10 min，倒入烧瓶，用蒸馏水洗涤，一起倒入烧瓶，冷却后加入20% KI溶液和1 mL 0.5%淀粉溶液，用0.2 mol/L硫代硫酸钠溶液滴定纤维素。纤维素含量按式（1）计算。

式中：c为硫代硫酸钠的浓度，mol/L；v为空白滴定时硫代硫酸钠被消耗的体积，mL；b为滴定溶液时硫代硫酸钠被消耗的体积，mL；m为样品质量，g；24为硫代硫酸钠（一定浓度）相当于1 moL C6H10O5的滴定度。

1.4.2 维生素C含量的测定方法（2, 4-二硝基苯肼法）

以吸光度为纵坐标，抗坏血酸的含量为横坐标，绘制标准曲线。线性回归方程为y=0.009 4x+0.073 8，R2=0.997 4。

在490 nm波长下进行比色，以空白管调零，测定处理好的样品的吸光度。

1.4.3 粗脂肪含量的测定方法

采用酸水解法。

1.4.4 蛋白质含量的测定方法

采用凯氏定氮法。

1.4.5 单宁含量的测定方法

样品处理：吸取10 mL原液，用100 mL容量瓶定容。

测定：吸取5 mL样液、5 mL靛红、100 mL蒸馏水，用浓度为0.01 mol/L的KMnO4快速滴定至黄绿色，再滴定到溶液为金黄色即为终点。

空白：取5 mL样液，加2 g活性炭，置水浴上加热搅拌10 min，过滤，再用热水洗涤数次。在滤液中加入5 mL靛红，补足100 mL水，滴定至金黄色[9]。单宁含量按式（2）计算。

式中：C为高锰酸钾标准溶液的摩尔浓度；V1为试样所消耗高锰酸钾的量，mL；V2为空白所消耗高锰酸钾的量，mL；V3为样品定容时提取液的总体积，mL；V4为测定时所取样品的体积，mL；m为样品的质量，g。

1.4.6 黄酮含量的测定方法（紫外分光光度法）

以芦丁质量浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。线性回归方程为y=0.004x+0.046 3，R2=0.994 1。

样品黄酮含量测定方法：取若干只干净的试管，分别加入0.5 mL空白样（95%乙醇）和试样，按照上述步骤操作，用酶标仪于可见光波长510 nm处测定其吸光度并记录读数。根据标准曲线表达式带入求得样品的黄酮含量。

1.4.7 多酚含量的测定方法（Folin-C法）

以多酚质量浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。线性方程为y=0.025 7x+0.070 6，R2=0.992 1。

样品多酚含量的测定：在765 nm处测定样品的吸光度。测得的吸光度代入标准曲线的方程，计算出提取液的浓度，提取液的浓度×提取液的体积=提取得到的多酚的质量。

1.4.8 五碳糖含量的测定方法

横坐标为木糖质量浓度（μg/mL），纵坐标为吸光度，绘制标准曲线。线性回归方程为y=5.430 1x+0.045 2，R2=0.993 3。

将蒸馏水作为空白对照，在665 nm处测定吸光度，并与标准溶液对照。

式中：A样为样品的吸光度；m为样品质量，g。

1.4.9 矿物质含量的测定方法（原子吸收分光光度法）

样品前处理：准确称取1.0 mL样品放入250 mL高型烧杯中，加入20～30 mL浓硝酸，在电热消化炉中密封加热。直至无色透明方可取下（期间如果酸不够，可适当加入少许酸）。取出烧杯，放置冷却，用去离子水冲洗，定容于50 mL容量瓶中。取与样品量相同的硝酸消化液做空白[10]。

标准曲线的绘制：将所购的标准样品液按一定梯度稀释，测定吸光光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程和相关系数，如表1所示。将处理好的样品进行测定，测定处理后样品的吸光度。

表1 矿物质样品的标准曲线

1.5 统计分析

所有指标每个样品做3个平行样，试验结果以平均值表示。

2 结果与分析

2.1 发酵过程啤酒糟果醋营养成分含量变化

2.1.1 基础营养成分含量变化分析

由表2可知，在整个发酵过程中，纤维素含量由一开始的29.60 mg/mL增长到醋酸发酵阶段的35.60 mg/mL，酒精发酵过程与醋酸发酵过程中纤维素含量均略有增加，但变化不显著。可以推测啤酒糟中含有丰富的纤维素（70%），在发酵过程中，啤酒糟中的纤维素被酵母菌吸收利用，啤酒糟中部分纤维素溶于果酒中。此外，醋酸菌在生物合成过程中，可以合成纤维素[11]，因此，啤酒糟果醋中的纤维素含量会更高。

表2 发酵过程中营养成分含量 单位：mg/L

在整体的发酵过程中，粗脂肪含量呈上升的趋势，与纤维素含量的变化趋势一致。这是由于酸水解法只测得样品中游离的脂肪和色素，而植物中很多脂溶性色素在发酵时溶于果酒、果醋中[12]。

酒精发酵过程中，蛋白质的含量由25.81 mg/mL大幅度下降到2.64 mg/mL，而醋酸发酵阶段含量又略有回升，为2.74 mg/mL。可能是在发酵过程中菌体进行生长繁殖和能量代谢，蛋白质被优先利用，所以前期被大量消耗[13]。后期，微生物的种群数量达到逻辑斯蒂曲线的顶峰，即不再繁殖，而已经被溶解于溶液中的蛋白质不再被菌体大量利用，故啤酒糟果醋中蛋白质的含量比啤酒糟果酒中蛋白质的含量略微增多。

发酵前，样品的维生素C的含量为0.002 2 mg/mL，酒精发酵期间迅速增加至0.28 mg/mL，醋酸发酵阶段又小幅度下降至0.24 mg/mL。可能是苹果制成匀浆时，加水稀释，使匀浆中维生素C含量不高，果醋中维生素C含量增高，考虑到啤酒糟中有相当数量的维生素C，故啤酒糟果酒和啤酒糟果醋中的维生素C可能来源于啤酒糟果醋的原料啤酒糟。醋酸发酵阶段，维生素C含量下降，因醋酸菌为需氧菌，需进行振荡摇床培养，部分维生素C可能在此过程中被氧化破坏，且维生素C在高温条件下也会被破坏，在高压灭菌时可能破坏部分维生素C，所以在醋酸发酵时维生素C有部分损失[14]。

矿物质和维生素一样是人体的必须元素。由表3可知，除了K元素在发酵过程中含量有较大的变化幅度以外，Fe，Mn，Zn，Na，Mg和Ca元素含量均含量变化不大。啤酒糟果醋中K元素的含量最高，为287.88 μg/g，Na，Mg元素次之，因此啤酒糟果醋具有良好的保健功能。

表3 矿物质含量 单位：μg/g

2.1.2 活性成分含量变化分析

黄酮广泛存在于植物界，以游离的形式存在，黄酮类化合物在预防心血管疾病等方面有不同程度的抑菌作用，是一种良好的抗氧化剂。由图1可知，黄酮含量由11.725 mg/mL大幅度增长至450.45 mg/mL，再小幅度增长至607.95 mg/mL。果醋中黄酮含量比苹果匀浆中的含量增长了52倍。因为黄酮主要来源于果蔬的外皮，且难溶于水，在发酵前黄酮含量较低。在酒精发酵阶段，生成大量乙醇（黄酮在乙醇中的溶解度比水大），苹果匀浆中存在的黄酮被大量溶出，使得黄酮含量上升。而在醋酸发酵阶段，在醋酸菌的作用下，pH逐渐降低，抑制了酶促褐变反应。酶促褐变反应是在有氧条件下，酚酶催化酚类物质形成醌及其聚合物的反应过程，因此醋酸发酵阶段黄酮物质含量上升。

图1 黄酮含量变化

多酚是一种可以促进健康的抗氧化剂。由图2可知，苹果匀浆多酚含量为5.08 μg/mL，而在醋酸发酵后含量变成152.43 μg/mL，较刚开始增加了30倍。多酚的变化趋势与黄酮相似，这种变化趋势的原因可能是发酵时酶作用使与糖结合的多酚类物质游离出来，更利于微生物的提取利用。

图2 多酚含量变化

单宁具有收敛作用，在红酒中较多，单宁的含量不仅能决定饮品的结构、风味，而且有益于心脏血管疾病和癌症的预防。由图3可知，酒精发酵前单宁含量为0.166 4 μg/mL，而酒精发酵后大幅度下降至0.020 8 μg/mL，醋酸发酵后又升高至0.124 8 μg/mL。原因可能是在酒精发酵过程中，单宁本身会发生聚合反应，结合蛋白质析出、进行氧化、与花色苷反应生成聚合色素或是因为非酶褐变反应而致使果酒中单宁含量大幅度下降了87.50%[15]；也有可能是发酵温度对单宁含量变化的影响，28 ℃下酒精发酵时酵母菌大量繁殖，糖类逐渐被分解，生成CO2、酒精和有机酸等物质，此时发酵液中糖的含量开始下降，导致单宁的含量也随之减少。在醋酸发酵过程中，随着时间的增加，单宁含量增加到0.124 8 mg/mL，原因是醋酸菌是需氧菌，发酵时振荡培养箱为之不断提供氧气，酚类前体物质被不断氧化、络合形成另外一种物质单宁，使得醋酸发酵阶段单宁含量又回升的现象[16]。

图3 单宁含量变化

五碳糖又称木糖，可以有效地改善人体内的微生物环境，增加机体免疫力，也可作为无热量甜味剂，且作为原料的啤酒糟中的多糖具有良好的抗肿瘤活性。由图4可知，发酵之前五碳糖的含量是44.789 mg/mL，酒精发酵后大幅度下降至8.699 mg/mL，醋酸发酵后又略有下降，至4.072 mg/mL，整体下降了90.90%。原因可能是在发酵过程中木糖作为能量来源，被微生物利用，从而转化成更利于人体吸收利用的木糖酸，木糖酸是许多重要化学变化的中间产物。

图4 五碳糖含量变化

3 结果与讨论

此次试验测定的苹果匀浆、酒精发酵、醋酸发酵三个阶段的9种营养物质中，纤维素、黄酮、粗脂肪、维生素C和多酚总体呈上升趋势，其中黄酮和多酚的含量增加最为显著。黄酮含量为607.95 mg/mL，显著增加52倍；多酚含量为152.43 μg/mL，增加了30倍。矿物质含量的变化并不显著，而蛋白质、五碳糖、单宁含量虽然总体呈下降趋势，但是其中的营养物质得到了不同程度的保留，使得啤酒糟果醋不仅拥有一般果醋的抗氧化、美容、减肥等功效，而且兼具了啤酒糟的促进肠道蠕动等优点，提高了啤酒糟的利用率，推动了啤酒糟在食品行业的新应用，同时为新型啤酒糟果醋的开发提供数据。