高速逆流色谱技术在中药及天然产物中的应用研究*

彭诗涛，刘振丽，宋志前，王 淳，梁东蕊，万晓莹，宋 超，宁张弛△

(1. 中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700；2. 首都医科大学附属北京佑安医院药学部，北京 100069)

中医复方发挥治疗作用与其药效物质基础密切相关，开展药效物质基础研究，对解释方药配伍规律、评估临床疗效具有重大意义[1]。中医复方中包含中药化学成分种类繁多、含量悬殊，给药效物质基础研究带来了巨大的挑战[2]，故采用必要的成分分离手段，是开展药效物质基础研究的途径之一。高速逆流色谱(high-speed counter-current chromatography，HSCCC)是一种高效连续的液-液分配色谱技术，其利用互不相溶的两相溶剂在螺旋管中高速行星式的运动，使分离物质在两相之间多次分配，进而实现目标成分快速高效的分离及制备[3]。液体固定相相较于固体固定相克服了对成分的吸附和污染问题，有效避免了活性成分的分解与失活。同时，HSCCC技术的操作条件温和、过程快速，具有成分不变性和无损失的优势。

随着科学技术的发展，早期HSCCC技术已难以满足复杂成分分离的需求，技术创新出现在HSCCC应用的各个环节，如溶剂体系、洗脱方式、检测技术以及与其他提取技术联合应用等(图 1)。这些技术革新为单体成分分离、化学组分分析及活性成分的发现提供了有力的技术支撑，从而拓展了HSCCC技术的应用空间，使得越来越多的中药及天然产物组分得以分离、活性成分得以发现。为使该技术更好地应用于中医复方药效物质基础研究，本文对相关领域的研究进行了归纳总结。

图1 高速逆流色谱技术提升研究图示

1 溶剂体系的改进

采用HSCCC技术对成分进行分离，首先要根据待分离成分的极性、溶解度等性质预选几个溶剂体系，然后通过薄层色谱法、高效液相色谱法等测定成分在体系中的分配系数，从而确定最佳的溶剂体系[4]。早期HSCCC技术通常采用两相溶剂体系，即将几种试剂按一定比例混合后形成上下两相；而后期三相溶剂体系的应用，实现了更多单体成分的分离。三相溶剂体系是由上、中、下三相组成，一般采用其中两相作为流动相，第三相作为固定相，或采用其中的两相分别作为固定相和流动相。

如Wu等[5]采用三相体系正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(4∶4∶3∶4，v/v/v/v)的上相/下相、上相/中相及中相/下相体系，成功分离了白芷、高良姜、知母中的水合氧化前胡素、白当归素等17个成分。Ito等[6]采用正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(1∶1∶1∶1，v/v/v/v)的上、中、下三相，组合成不同的溶剂体系，实现了从色氨酸到β-胡萝卜素的大跨度极性范围标准物质分离。另有采用正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(1∶1∶1∶1，v/v/v/v)的中相为流动相，下相为固定相分离苹果属植物中的极性低聚物儿茶素的报道[7]。为建立不同极性维生素类成分的分离方法，通过以正己烷-甲基叔丁基醚-乙腈-水(5∶5∶7.5∶5，v/v/v/v)的上相为流动相、中相为固定相，实现了脂溶性维生素的分离；同时使用上述溶剂体系的下相为流动相、中相为固定相，分离得到水溶性维生素成分[8]。Yanagida等[9]运用正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(4∶4∶3∶4，v/v/v/v)三相体系，分离得到儿茶素、咖啡因等多个天然产物提取物的二级代谢产物成分。水黄皮中黄酮类化合物的分离以正己烷-乙腈-二氯甲烷-水(5∶5∶1∶5，v/v/v/v)体系中不同比例中相和下相混合溶剂(0.3∶0.7、0.1∶0.9，v/v)为固定相，上相为流动相，或以下相为固定相，上相为流动相实现[10]。报道显示，三相溶剂体系正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(3∶6∶5∶5，v/v/v/v)可被用于蟾蜍二烯羟酸内酯的快速富集和分离[11]。Kamto等[12]通过调整固定溶剂体系中有机溶剂与水的比例，实现了链荚木属植物中多种成分的分离。另有采用三相溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-乙腈-水(7∶3∶5∶5，v/v/v/v)从链霉菌中提取大环酯类抗生素巴佛洛霉素A1的报道[13]。有学者比较了多种溶剂体系对乳香中乳香酸类成分的分离效果，发现三相溶剂体系正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(4∶4∶3∶4，v/v/v/v)的上中两相，对于极性小且极性相近的乳香酸类成分的分离能力明显优于两相溶剂体系，最终分离得到18个乳香酸单体成分[14]。

此外，某些特殊试剂也在溶剂体系中起到特殊作用。如双重手性选择剂Cu(II)-1-丁基-3-甲基咪唑-[L-脯氨酸]与羟丙基-β-环糊精用于柚皮素的手性分离[15]。离子对试剂七氟丁酸的添加实现了千日红中β-花青苷的分离[16]。

溶剂系统的选择是采用HSCCC技术分离中药及天然产物的核心步骤，同时也是难度最大的环节。Ito法、HBAW法和ARIZONA法是经典的多元溶剂体系的选择方法，此外还有基于溶剂极性的分类选择方法，但这些方法多针对两相溶剂体系，在溶剂的选择范围方面还存在一定的局限性。近年来，三相溶剂的发明扩展了溶剂的选择范围，兼顾了更多化学成分的性质，大大节约了溶剂的使用量，对于多种化学成分的快速分离发挥了重大作用。特殊试剂的加入满足了特殊化学基团成分的分离，但三相溶剂体系和特殊试剂的使用尚缺乏系统的理论指导。

2 洗脱方式的提升

中药及天然产物中化学成分数量众多，传统的HSCCC技术多采用线性洗脱方式，但该方式对于结构相似成分的分离效果欠佳。学者们通过采用梯度洗脱、内循环洗脱以及两步洗脱等溶剂泵洗脱改进方式，使HSCCC在成分分离中发挥了更大作用。

据报道，有学者通过对正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系比例和洗脱方式的改进，实现了葡萄属中性质相近的二苯乙烯苷类低聚物的分离[17]。研究者通过改进线性洗脱和梯度洗脱的两步洗脱方式，实现了芒果花中没食子酸及榈酸乙酯2个酚性成分的分离[18]。利用六通阀的切换使得洗脱时间和距离延长，可有利于海棠叶中多酚类成分的分离[19]。Song等[20]结合线性洗脱以及内循环2种洗脱方式，对番荔枝叶中的黄酮苷类成分进行了分离，以线性洗脱方式分离了分配系数相差较远的成分，以内循环洗脱方式分离了分配系数相近的成分。

洗脱方式的技术提升，大大扩展了HSCCC技术在中药及天然产物分离方面的应用。针对化合物本身的性质、结构特征以及多种化学成分之间的差异，学者们可以根据不同的分离需求灵活地对溶剂配比及洗脱时间进行设定。循环洗脱方式的出现，在延长洗脱时间的同时也大大节省了溶剂的使用，使得化学成分的分离实验更加环保和绿色。

3 检测技术的提升

早期HSCCC技术连接最多的是紫外检测器，但该检测器对吸收较弱或无紫外吸收的成分检测效果微乎其微。后期质谱、傅立叶红外光谱、蒸发光散射以及示差折光等检测技术的联合应用，拓展了HSCCC技术的使用范围。同时，HSCCC技术与液相色谱分离技术的结合，进一步增强了对化学成分的分离与分析能力。

据报道，采用分析型HSCCC与液相色谱-质谱联用技术，分离纯化得到了木蝴蝶乙酸乙酯部位的鞣花酸和乙基棓酸[21]。HSCCC连接电喷雾质谱检测器，通过搭建馏分收集器和检测器之间的T型分流装置，并根据进样量选择恰当的分流比，从茶叶中分离到原儿茶酸和黄酮苷类等多种多酚类化合物[22]。为实现甜青柠中微量成分的分离和分析，采用HSCCC和液相色谱-质谱联用技术对目标成分进行分离与结构鉴定，从而大大提高了成分的检测灵敏度[23]。HSCCC与液相色谱-质谱的联用还被用于胡桃木中化学成分的分离和分析，该技术不仅可以实现成分的分离，还能够实现结构鉴定与检测成分纯度[24]。

此外，HSCCC还有应用于成分的提取和敲除的相关报道，进而实现成分活性评价[25]。首先通过HSCCC-液相色谱-质谱联用选取感兴趣的化学信息，再采用HSCCC技术提取或敲除其余信息，最后对分离得到的化合物进行生物活性检测。如采用离线的中心切割HSCCC与液相色谱-质谱联用，线下借助1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)绘制出葡萄茶中具有抗氧化作用的成分轮廓图，进一步分离得到15个具有抗氧化活性的黄酮类成分[26]。此外，还利用此方法发现了高良姜中具有抗氧化活性的成分[27]，并联合HSCCC制备液相色谱从忍冬叶中分离出具有抗氧化活性的黄酮苷和咖啡酰奎宁酸[28]。杜仲叶[29]和中华卷柏[30]中抗氧化成分的研究也采用了同样的思路。在超高效液相色谱与多级质谱联用的基础上，Zhao等[31]从芫花中分离得到具有抗艾滋病毒活性的瑞香烷二萜类成分。

与紫外检测器不同，蒸发光散射等检测器对成分具有破坏性，故以制备为目的HSCCC应用多连接T型分流装置或采用线下连接的方式逐一对样品进行检测。由于抗氧化活性表征指标较为成熟，且操作简单、具有较强的可行性，因此活性检测器多以抗氧化检测为主。Gong等[32]对HSCCC技术在天然抗氧化剂的分离方面进行了系统总结，HSCCC与抗氧化活性检测器的联合应用有望对天然抗氧化剂的挖掘与评价做出重要贡献。联合活性试验的HSCCC技术也对新药先导化合物的发现和筛选具有重要意义。其他活性检测方式如果能够找到适宜的表征指标，那么HSCCC在中药及天然产物方面的研究将更有前景。

4 HSCCC与其他提取技术的联合应用

中药及天然产物成分复杂，天然活性物质研究面临着分离效率低、活性成分流失的问题。近年来，有将新兴提取技术与HSCCC联用的相关报道，为提升活性成分的分离效率提供了参考。有学者采用CO2超临界流体萃取法，首先将艾蒿中的茴蒿素分离，进一步采用HSCCC技术从艾蒿中分离京尼平苷酸[33]。针对目标成分的化学特性将提取分离方法有机地结合，通过响应面法进行优化，采用超声波协助提取，并通过HSCCC技术对枸杞中的类胡萝卜素成分进行分离[34]。液液精萃与HSCCC联合技术被提出，并且在蒲公英和蓍草的成分提取和分离中得到应用[35]。Wang等[36]建立了水解提取-HSCCC法分离纯化甘草中甘草素和甘草次酸的制备方法，甘草素和甘草次酸是甘草苷与甘草酸的水解产物，针对水解产物的分离和纯化，将水解提取与HSCCC结合，大大扩展了HSCCC的分离范围。

5 近年HSCCC技术在分离中药及天然产物化学成分的应用

分离与制备中药和天然产物的生物活性成分，是进行结构鉴定和药理药效学研究的基础工作。HSCCC技术采用液液分配原理，避免了固体载体对成分的吸附和降解作用，被广泛用于中药及天然产物中黄酮、生物碱、木脂素、三萜和多酚类等化学成分的分离。对于黄酮苷类等较大极性成分，通常使用乙酸乙酯-水为基本组成的溶剂系统，如莲、假泽兰、葡萄籽中黄酮苷类成分的分离。生物碱类成分大多可以选用正己烷(石油醚)-乙酸乙酯-甲醇(乙醇)-水的溶剂体系。多数萜类成分极性较小，溶剂系统多采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、石油醚-乙醇-水，如乳香中乳香酸类成分、灵芝中灵芝酸的分离。针对多酚类成分，通常选用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的溶剂系统，如分离夜来香籽和柿中的没食子酸。而对于聚合度高、分子量较大、羟基个数较多的多酚类成分，则采用正丁醇-水为基础构成的溶剂体系，这类成分在紫外光下有较好的吸收，可采用紫外检测器进行检测。

正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂体系可以分离糖苷类、多酚类、苯丙素类以及羟基不饱和脂肪酸等成分。有学者采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.5∶5∶1.5∶5，v/v/v/v)从夜来香籽(OenotherabiennisL)中分离出没食子酸、原花青素B3、儿茶酸和没食子酸甲酯，这些成分被认为是有效的醛糖还原酶抑制剂，具有潜在的抑制糖尿病并发症的作用[37]。Hu等[38]从阔叶十大功劳(Mahoniabealei(Fort.)Carr.)中分离出绿原酸、槲皮苷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖、异鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖，并发现其具有抗氧化作用。正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶12∶1∶12，v/v/v/v)可从白芍(RadixPaeoniaeAlba)中提取出1,2,3,4,6-五没食子酰基-β-D-葡萄糖，该单体可能通过MAPK和NF-κB途径来减轻TNF-α介导的脂肪细胞炎症[39]。Sun等[40]开发了一种HSCCC策略与在线存储回收洗脱技术相结合的方法，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(9∶6∶6∶8，v/v/v/v)从苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)中分离出山豆根紫檀综苷、苦豆酮等成分。Cen等[41]采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.5∶5∶1.5∶5，v/v/v/v)从南五味子(KadsuralongipedunculataFinet et Gagnep)中分离出槲皮素-3-O-鼠李糖苷和原儿茶酸，该方法快速、有效，是从中药中筛选和分离潜在活性化合物的良好方法。金钱草具有解毒消肿的功效，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3.5∶5∶3.5∶5，v/v/v/v)可从金钱草(Sinopodophyllumemodi(Wall.)Ying)中分离出异戊烯基化双黄酮B和异戊烯基化双黄酮C[42]。Feng等[43]采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(7∶12∶11∶5，v/v/v/v)从灵芝(Ganodermalucidum)中分离出灵芝酸S、灵芝酸T、灵芝醛B，它们是灵芝中主要的生物活性三萜。采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶4∶2∶6，v/v/v/v)可从胡芦巴(Trigonellafoenum-graecumL.)中大规模分离和纯化大黄苷、丹叶大黄素[44]。黄花刺茄(Solanumrostratum)是一种对癌细胞具有毒性作用的植物，研究发现，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶7∶1∶7，v/v/v/v)可从其中分离出金丝桃苷、3’-O-甲基槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、紫云英苷、3′-O-甲基槲皮素-3-O-β-D葡萄糖苷等单体成分[45]。Shaheen等[18]采用己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶4∶6，v/v/v/v)和二氯甲烷-甲醇-水(4∶3∶2，v/v/v)两步HSCCC法，对芒果花(Mangiferaindica.L)中没食子酸、没食子酸乙酯和鞣花酸进行了分离和纯化。Yan等[46]利用超临界CO2流体萃取从小米椒(CapsicumfrutescensL. (Solanaceae))中提取辣椒素和二氢辣椒素，并进一步采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.4∶0.6∶1.0∶1.0，v/v/v/v)对其进行纯化，结果表明，该方法高效、实用，可大规模地实现小米椒中辣椒素和二氢辣椒素的高效制备。正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(10∶2∶5∶7，v/v/v/v)可从节鞭山姜(AlpiniaconchigeraGriff)中分离出6-姜辣素，该化合物在体外具有良好的抗氧化活性[47]。马蔺(IrislacteaPall. var. chinensis(Fisch.)Koidz)是一种鸢尾科植物，具有保肝、抗氧化、抗肿瘤的药理活性，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶5∶3∶6， v/v/v/v)[48]可从马蔺中提取出Vitisin D，白蔹素B和Vitisin A反式异构体，这些单体可能具有潜在的药效作用。马桑根瘤菌(CoriarianepalensisWall,L.hammesii,L.plantarum)可以被正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶1.5∶3∶2，v/v/v/v)提取出具有良好抑菌作用的羟基不饱和脂肪酸[49]。Liu等[50]采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶2∶0.625，v/v/v/v)从永嘉早香柚(Citrus grandis(L.)Osbeck cv.)中分离出佛手柑素，该化合物首次被报道具有治疗糖尿病的潜力。Wang等[51]采用2种不同比例的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶2∶5∶2、6∶1∶6∶1.2，v/v/v/v)，首次从杜仲(Eurycomalongifolia)中分离出longifolione A、longifolione B、longifolione C、longifolione D、longifolione E 5种化合物。此外，HSCCC还可用于霉菌中成分的分离。Sun等[52]采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(6.5∶3.5∶5∶5，v/v/v/v)从稻曲菌(Villosiclavavirens;UstilaginoideavirensTakahashi)中分离出稻曲菌素A、稻曲菌素G、稻曲菌素B、稻曲菌素H、稻曲菌素I、稻曲菌素C和稻曲菌素J，并对其结构做了进一步表征。正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.1%甲酸水(1∶5∶1∶5，v/v/v/v)可从红曲霉(Monascus)中分离出黄单胞杆菌A和B[53]。2种不同比例的己烷类-乙酯-甲醇-水(6∶4∶5∶5、8.5∶1.5∶5∶5，v/v/v/v)，可从赤霉菌(Gibberella)中分离出杆孢菌素E、杆孢菌素E醋酸酯、疣孢菌素L醋酸酯、疣孢菌素J等成分，为相关标准物质研究提供了借鉴[54]。

石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂体系可以分离酚类、酯类、酸类以及生物碱类成分。有学者采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(0.8∶1∶1∶0.8，v/v/v/v)从高良姜(AlpiniaofficinarumHance)中分离出纯化高良姜素和山奈酚，两者均表现出显著的抗氧化活性[27]。Guo等[55]采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(8∶4∶7∶5，v/v/v/v)从厚朴(MagnoliaofficinalisRehd. Et Wils.)中分离出和厚朴酚、厚朴酚、木兰箭毒碱、木兰花碱、毛蕊花糖苷等成分，为厚朴的质量控制与临床应用研究提供了参考。除虫菊(Chrysanthemum cineraraeflium)提取物被认为是天然的杀虫剂，除虫菊酯是其主要有效成分，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(10∶2∶10∶2，v/v/v/v)是从除虫菊中快速分离、纯化除虫菊酯的有效方法[56]。Cao等[57]采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶1∶6.5∶3.5，v/v/v/v)从木香(RadixAucklandiae)中分离出10α-甲氧基青蒿素酸、木香烯内酯、去氢木香内酯，并进一步对其结构进行了鉴定。石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶3∶0.5∶5，v/v/v/v)可用于菝葜(SmilaxchinaL.)中5-O-咖啡酰莽草酸、紫杉叶、新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、黄杞苷成分的分离制备[58]。此外，不同体积比的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水还可用于牛蒡根(ArctiumlappaL.)中1,5-O-1,5-二咖啡酰奎宁酸、3-O-咖啡酰奎宁酸甲酯和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸等10种成分的分离制备[59]。石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶0.7∶1∶0.7，v/v/v/v)可实现爵床(Justicia procumbens L.)中爵床脂素A、爵床脂素B、6’-羟基爵床脂素C等10种成分的分离纯化，且纯度均在94%以上[60]。Li等[61]采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶3∶7，v/v/v/v)、 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(5∶5∶3∶7∶0.02、5∶5∶4.3∶5.7∶0.02，v/v/v/v/v)、乙酸乙酯-正丁醇-甲酸-水(4∶1∶0.5∶5，v/v/v/v)从腊梅花(Chimonanthuspraecox(Linn.)Link)中分离出3,4-二羟基苯甲酸、原儿茶醛、对香豆酸等8种化合物，并进一步对其结构进行了鉴定。刺五加(AcanthopanaxSessiliflorus(Rupr. & Maxim.)Seem)是五加属最丰富的物种之一。研究者采用甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸(3.5∶0.5∶1.5∶0.01，v/v/v/v)从刺五加中分离出矢车菊素3-木糖基半乳糖苷，并表明其具有显著的抗氧化作用[62]。丹参(SalviaMiltiorrhizaBunge)是临床常用的活血化瘀药物，Yang等[63]采用甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水(3∶1∶1∶20，v/v/v/v)从丹参中分离出芦丁、异槲皮苷、山奈酚-3-O-α-鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖和芹黄素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖，其中芦丁和异槲皮苷具有较强的抗氧化能力。氯仿-二氯甲烷-甲醇-水(4∶2∶3∶2，v/v/v/v)可从猴头菇菌(Hericium erinaceum Mycelium)分离出染料木黄酮和黄豆苷元，表明HSCCC是从天然产物中高效分离和纯化生物活性物质的有力工具[64]。Wu等[65]采用乙酸乙酯-正丁醇-水(1∶2∶3，v/v/v)从莲(NelumbonuciferaGaertn.)中首次分离出槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖基-8-C-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、芹菜素-6,8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷4种黄酮苷类成分，并对其结构进行了确认。Zhu等[66]采用乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶5∶1，v/v/v)从南美番荔枝叶(AnnonasquamosaLinn)中分离出槲皮素-3-O-洋槐糖苷、芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷，其中前三者在降血糖方面表现出良好的活性。己烷-乙酸乙酯-水(1∶50∶50，v/v/v)是从可可树(Theobromacacao)[67]中分离二聚原花青素B2的有效方法。己烷-乙酸乙酯-水(1∶50∶50，v/v/v)和乙酸乙酯-水(1∶1，v/v)可葡萄籽(VitisviniferaL.)[68]中分离出17种原花青素成分，且每种成分均具有较高的收率和纯度，表明HSCCC是一种高效、快捷的成分分离方法。

此外，不同组成及配比的其他溶剂系统还可对中药及天然产物进行单体成分的分离。Wen等[69]采用氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1.5，v/v/v/v)，从山楂叶(Crataeguspinnatifida)中分离出表儿茶素、金丝桃、异槲皮苷等7个成分，并进一步对其结构鉴定。Zhou等[70]采用乙酸乙酯-甲醇-正丁醇-水(9∶1∶0.5∶9，v/v/v/v)，从沙棘(HippophaerhamnoidesLinn)中分离出槐樟醇-7-O-{3-O-[2(E)-2,6-二甲基-6-羟基-2,7-辛二烯]}-α-L-鼠李糖苷和hippophanone 2种新化合物。Wang[71]等采用乙酸乙酯-甲醇-水(25∶1∶25，v/v/v)，从假泽兰(Mikaniamicrantha)中分离出槲皮素-3-O-芸香糖苷、木犀草苷、黄芩苷和黄芪素，结果表明磁纳米颗粒-HSCCC在线分离系统高效、可回收，可用于从天然产物中极性相似黄酮类化合物的分离。Xu等[72]采用正丁醇-叔丁基甲基醚-乙腈-水-不饱和脂肪酸(2∶2∶1∶5∶0.01，v/v/v/v)，从草莓(FragariaananassaDuch.)中分离出花葵素-3-O-葡萄糖苷，该成分可以用作天然生物活性剂，以防止细胞氧化应激。研究报道，利用正己烷-乙醇-水等多种溶剂体系，从红木树皮(Ormocarpumkirkiibark)中分离出吡喃葡萄糖、柚皮素等14种极性不同的化合物，表明HSCCC分离成分无损失且溶剂用量少，是一种高效的天然产物分离方法[12]。Li等[73]采用氯仿-甲醇-水溶剂体系，从野菊花(DendranthemaindicumL.)中分离出金合欢素、芹菜素、木犀草素、蒙花苷等单体，进一步明确了野菊花抗骨质疏松作用的机制。醋乳香为乳香(Boswelliacarterii)经醋炙后所得的中药饮片，研究者采用正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(4∶4∶3∶4，v/v/v/v)从醋乳香中分离出α-乳香酸等18种成分[14]。有学者[74, 75]采用己烷-乙酸乙酯-水(1∶50∶50，v/v/v)从葡萄(VitisviniferaL.)中分离出儿茶素、表儿茶素、肉豆蔻酸、咖啡酸和原花青素等多种化合物，表明HSCCC与制备型HPLC联用方便、高效，是分离葡萄中多酚类成分的有效策略。Kucab等[76]采用叔丁基甲基醚-丁醇-乙腈-水和等溶剂体系，从鸡冠花(CelosiacristataL.)中分离出甜菜红素，并对其中的β-花青素进行了首次测定。Liu等[77]采用乙酸乙酯-正丁醇-水(3∶2∶5，v/v/v)和正丁醇-水-甲醇-乙酸乙酯(1∶6∶0.5∶4，v/v/v/v)从秀山金银花(Loniceramacranthoides)中分离出木通皂苷D等4种皂苷类成分，且这些成分均表现出良好的抗肿瘤活性。正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(5∶6∶5∶5，v/v/v/v)是绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum)中商陆苷有效的分离纯化方法[78]。Marques等[79]采用正己醇-乙腈(1∶1，v/v)和正己烷-乙腈-乙酸乙酯(1∶1∶0.4，v/v/v)，从胡椒(Piperclaussenianum(Miq.)C.DC.(Piperaceae))中分离出橙花叔醇、芳樟醇等成分，表明HSCCC技术对于分离萜烯物质具有良好的应用价值。Chen等[80]采用乙酸乙酯-丁醇-水(2∶1∶3，v/v/v)和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶3∶1∶3，v/v/v/v)，从龙胆(GentianascabraBunge)中分离出番木鳖酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和三叶苷4种化合物，这些化合物均具有良好的抑制一氧化氮分泌作用。Cho等[81]采用乙酸乙酯-乙腈-水(1∶0.1∶1，v/v/v)，从白桦(BetulaplatyphyllaSuk.)中分离出aceroside VIII和platyphylloside，并对癌细胞表现出剂量依赖性抑制作用，可能是癌症的靶向治疗剂。Geng等[82]采用丁醇-乙酸-水(4∶1∶5，v/v/v)从甘蔗(SaccharumsinensisRoxb.)中分离出对香豆酸、阿魏酸等单体，提高了天然产物的综合利用价值。此外，利用乙酸乙酯-甲醇-水(25∶1∶25，v/v/v)可从大叶藤黄(Garciniaxanthochymus)中分离出大叶藤黄醇和guttiferone E，实现了异构体的良好分离[83]。Lu等[84]采用正己烷-正丁醇-水(3∶2∶5，v/v/v)从长果婆婆纳(VeronicaciliataFisch.)中分离出木犀草素、4-羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸等5种化合物，并研究表明其均具有良好的抗肝癌活性。Du等[85]采用正己醇-丙酮-乙醇-水(1∶1∶1∶1，v/v/v/v)首次从红法夫酵母(Phaffiarhodozyma)中分离出虾青素，并对其进行了结构确认。乙酸乙酯-丁醇-1.5% 水合氢氧化铵(1∶4∶5，v/v/v)可从冬虫夏草(Cordycepsmilitaris)[86]中分离出3种核苷，且其纯度均在98%以上。

通过对HSCCC在中药及天然产物物质基础研究应用的相关文献进行分析，为中药及天然产物物质基础的溶解系统选择和溶剂比例等方面提供了借鉴。HSCCC具有分离结果纯净、制备量较大、重现性好、操作简便等优点，可用于高纯度活性物质对照品的制备。

6 小结

中医复方是中药在临床应用中的基本形式，开展中药药效物质基础研究对于推动中医药现代化进程至关重要。中药及天然产物的活性成分是新药发现的重要来源[87]。随着复方药效物质基础研究的推进，中药复方药效物质基础虽未完全阐明，但在不同层面上都取得了一定进展。如若实现进一步的突破，更需思想与方法的多元化。HSCCC技术不仅可以分离得到单体成分，还可以实现全成分分段分离，发现活性部位甚至活性成分，这在一定程度上克服了中医复方研究中药效成分种类众多、含量悬殊带来的挑战。近些年，基于溶剂体系、洗脱方式、检测技术以及与其他分离技术联用的创新研究，极大地推动了HSCCC技术的应用，具有十分重要的意义。

虽然HSCCC技术不断进步，但其广泛应用仍然受到制约。尽管有学者建立了经验性的溶剂体系筛选方法[87]，但在实际应用中受到操作者个人经验的影响。目前HSCCC技术虽已经实现了上百毫克级乃至数十克级成分的分离制备，但对于数百克级甚或公斤数量级的制备能力还有待提高。相信随着科学技术的进步与发展，HSCCC技术将为中药复方药效物质基础研究提供更加完备的技术支撑。