瑞芬太尼通过调控miR-574-3p对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响及机制研究

韦登文，覃 年，廖艳英

心肌缺血再灌注损伤是引起心肌梗死、冠心病等心血管疾病的重要原因之一，因而减轻心肌缺血再灌注损伤成为研究重点[1-2]。部分研究显示，麻醉药物能够减轻心肌缺血再灌注损伤，但其作用机制尚未阐明[3-4]。瑞芬太尼属于芬太尼类μ型阿片受体激动剂，其可抑制炎症反应及心肌细胞凋亡，从而减缓糖尿病动脉粥样硬化的发展[5]。miR-574-3p在心血管疾病中表达异常，并可能参与心血管疾病的发生及发展过程[6]。但miR-574-3p是否可作为瑞芬太尼减轻心肌缺血再灌注损伤的作用靶点，目前研究报道尚少。因此，本研究用缺氧/复氧处理心肌细胞，并建立心肌缺血再灌注损伤模型，探讨了瑞芬太尼对缺氧/复氧诱导的心肌细胞活性及凋亡的影响及其对miR-574-3p的调控作用。

1 材料与方法

1.1实验材料与试剂 注射用盐酸瑞芬太尼(宜昌人福药业有限公司，国药准字：H20030197)；大鼠心肌细胞H9C2(上海通派生物科技有限公司)；DMEM(美国Gibco)；胎牛血清、Lipofectamine2000(美国Thermo Fisher)；Trizol(美国Invitrogen)；反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒(北京天根有限公司)；anti-miR-con、anti-miR-574-3p、miR-con、miR-574-3p mimics(广州锐博生物技术有限公司)；MTT、凋亡检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗鼠人CyclinD1、Cleaved-caspase-3与二抗(美国Santa Cruz公司)。

1.2方法

1.2.1实验分组：将H9C2细胞接种于24孔板(1×104个/孔)后，置于含有体积分数为95%氮与5%二氧化碳(CO2)培养箱内缺氧处理24 h；弃旧培养基后加入DMEM新鲜培养基，将其置于37℃、体积分数5%CO2培养箱复氧处理6 h[7]，建立心肌细胞缺氧/复氧模型并记为模型组。将未经处理的H9C2细胞记为对照组。H9C2细胞分别加入含有不同浓度(10、30、60 ng/ml)瑞芬太尼的培养基处理24 h[8]，然后进行缺氧/复氧处理，分别记为低剂量组、中剂量组、高剂量组。用脂质体转染法分别将anti-miR-con、anti-miR-574-3p转染至H9C2细胞24 h后再进行缺氧/复氧处理，分别记为anti-miR-con组、anti-miR-574-3p组。用脂质体转染法分别将miR-con、miR-574-3p mimics转染至H9C2细胞后加入含有60 ng/ml瑞芬太尼的培养基处理24 h，然后再进行缺氧/复氧处理，分别记为高剂量miR-con组、高剂量miR-574-3p组。

1.2.2MTT检测细胞活性：收集各组H9C2细胞接种于96孔板(4×103个/孔)，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl；培养箱中继续培养4 h，离心后弃上清，每孔加入150 μl DMSO，室温避光振荡孵育5 min，以酶标仪检测各孔吸光度值(A490 nm)。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡率：取“1.2.1”处理后的H9C2细胞用500 μl结合缓冲液重悬，按照凋亡试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.2.4MDA、SOD含量检测：取“1.2.1”处理后的H9C2细胞，用反复冻融法裂解细胞，根据试剂盒说明书检测MDA、SOD含量。

1.2.5qRT-PCR检测miR-574-3p的表达水平：用Trizol法提取处理后的H9C2细胞总RNA，应用紫外分光光度计测定RNA浓度。按照反转录试剂盒说明书配置反应体系，反应条件：42℃ 15 min，95℃ 3 min。RNA反转录合成cDNA后进行qRT-PCR扩增，反应体系按照SYBR Green试剂盒说明书操作，用ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪检测miR-574-3p的表达量。

1.2.6Western blot检测CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达：取“1.2.1”处理后的H9C2细胞，加入适量RIPA裂解液提取细胞总蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，蛋白变性后进行SDS-PAGE，转移至PVDF膜后室温封闭2 h，4℃孵育CyclinD1(1∶1000)、Cleaved-caspase-3(1∶1000)、GAPDH(1∶3000)一抗过夜，室温孵育二抗稀释液(1∶5000)1 h，ECL显影，用Image J软件分析各条带灰度值。

2 结果

2.1心肌H9C2细胞活性和凋亡率比较 与对照组比较，模型组细胞活性和CyclinD1蛋白表达水平降低，细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，低、中、高剂量组细胞活性和CyclinD1蛋白表达水平升高，细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表达水平降低，且随剂量的增加变化更显著，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表1。

表1 5组心肌H9C2细胞活性和凋亡率比较

图1 不同浓度瑞芬太尼对缺氧/复氧心肌H9C2细胞活性和凋亡的影响

2.2心肌H9C2细胞中MDA、SOD含量比较 与对照组比较，模型组MDA含量升高，SOD含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，低、中、高剂量组MDA含量降低，SOD含量升高，且随剂量增加变化更显著，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 5组心肌H9C2细胞MDA、SOD含量比较

2.3心肌H9C2细胞中miR-574-3p表达水平比较 5组心肌H9C2细胞中miR-574-3p表达水平分别为对照组1.00±0.08、模型组3.19±0.21、低剂量组2.76±0.12、中剂量组1.83±0.12、高剂量组1.33±0.10。与对照组比较，模型组miR-574-3p表达水平升高(P<0.05)；与模型组比较，低、中、高剂量组miR-574-3p表达水平降低，且随剂量增加表达水平进一步降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4转染anti-miR-con、anti-miR-574-3p后心肌H9C2细胞活性、凋亡和氧化应激指标比较 与anti-miR-con组比较，anti-miR-574-3p组细胞活性、CyclinD1蛋白表达水平、SOD含量升高，miR-574-3p表达水平、细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表达水平、MDA含量降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2、表3。

表3 转染anti-miR-con、anti-miR-574-3p后2组缺氧/复氧心肌H9C2细胞活性、凋亡和氧化应激指标比较

图2 转染后2组H9C2细胞CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白免疫印迹图

2.5高剂量瑞芬太尼组转染anti-miR-con、anti-miR-574-3p后缺氧/复氧心肌H9C2细胞活性、凋亡和氧化应激指标比较 与高剂量+miR-con组比较，高剂量+miR-574-3p组细胞活性、CyclinD1蛋白表达水平、SOD含量降低，miR-574-3p表达水平、细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表达水平、MDA含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、表4。

表4 高剂量瑞芬太尼对转染anti-miR-con、anti-miR-574-3p后2组缺氧/复氧心肌H9C2细胞活性、凋亡率和氧化应激指标比较

图3 高剂量瑞芬太尼组转染anti-miR-con、anti-miR-574-3p后2组缺氧/复氧心肌H9C2细胞CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白免疫印迹图

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤可加重心肌功能障碍及心肌组织损伤，研究发现麻醉药物预处理可明显减轻心肌细胞损伤，还可抑制氧化应激及细胞凋亡[9]。miRNA在多种心血管疾病中表达异常，并可通过靶向调控下游靶mRNA表达减缓心血管疾病的发展进程[10-11]。但麻醉药物是否可通过调控miRNA发挥作用尚未被阐明。瑞芬太尼可抑制氧化应激、炎症反应及肺泡细胞凋亡，从而减轻内毒素诱导的急性肺损伤[12]。瑞芬太尼可减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，并可抑制神经元凋亡[13]；还可通过抑制炎症反应及细胞凋亡从而减轻肾缺血再灌注损伤[14]。研究表明CyclinD1能够与CDK4结合形成复合物，从而正向调控细胞周期，促进细胞增殖[15]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组细胞活性和CyclinD1蛋白水平降低，凋亡率升高；与模型组比较，瑞芬太尼各剂量组细胞活性和CyclinD1蛋白水平升高，凋亡率降低，且随剂量的增加变化更显著。提示缺氧/复氧诱导的心肌细胞中细胞活性和CyclinD1蛋白水平降低，瑞芬太尼可促进缺氧/复氧诱导的心肌细胞增殖。

心肌细胞活性和CyclinD1蛋白表达水平升高，提示线粒体途径激活后可促使Caspase-3活化而诱导细胞凋亡[16]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组心肌细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高；与模型组比较，瑞芬太尼各剂量组心肌细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平降低，提示瑞芬太尼可抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡。本研究结果显示，模型组MDA含量升高，SOD含量降低，与既往研究结果相似[17]。本研究结果显示，瑞芬太尼各剂量组MDA含量降低，SOD含量升高，提示瑞芬太尼可增强缺氧/复氧诱导的心肌细胞抗氧化能力，但其分子机制尚需进一步探究。

本研究结果显示，模型组miR-574-3p的表达水平升高，而瑞芬太尼各剂量组心肌细胞中miR-574-3p的表达水平降低，提示瑞芬太尼可能通过下调miR-574-3p的表达而减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤。miR-574-3p在食管癌、卵巢癌、白血病中表达下调，上调其表达可抑制细胞增殖及转移而诱导细胞凋亡[18]。本研究结果显示，抑制miR-574-3p表达后缺氧/复氧诱导的心肌细胞活性升高，凋亡率降低，MDA含量降低，SOD含量升高，进一步研究发现，miR-574-3p过表达可拮抗瑞芬太尼对缺氧/复氧诱导的心肌细胞活性、凋亡及氧化应激。

综上所述，瑞芬太尼可通过下调miR-574-3p的表达而增强缺氧/复氧诱导的心肌细胞活性及抗氧化能力；并可抑制心肌细胞凋亡进而减轻心肌细胞损伤，为心血管疾病患者围术期合理使用镇痛药物瑞芬太尼提供理论依据；还可为保护患者心功能提供新的治疗靶点及方向。