ABO等位基因调控区突变致抗原弱表达原因分析

顾玉微，王成云，顾 萍，潘秋辉，王 静，陈广洁

（1.上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心输血科，上海 200127；2.上海交通大学医学院，上海 200025）

ABO血型系统在输血医学、移植学和法医学中有着极其重要的作用，是目前最具临床意义的血型系统[1]。人类ABO血型基因位于9q34.1-34.2，含7个外显子和6个内含子，编码区长1 062 bp，基因上游5'非编码区存在1个总长度为18～20 kb的调控区[2-3]。ABO基因外显子和内含子的突变、插入或缺失，以及受不同mRNA转录剪接模式的影响，调控区出现等位基因重组、片段缺失、甲基化/去甲基化或CpG岛形成等，均可导致ABO抗原表达的弱化。本研究对1例ABO血清学鉴定困难的患儿进行基因序列测定和序列分析，查找抗原弱表达的原因。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取上海儿童医学中心心胸外科收治的二尖瓣返流患儿1例，女，12岁，术前检查发现血型鉴定正反定型不符。

1.2 仪器和试剂

WADiana/8XT全自动血型系统（西班牙Diagnostic Grifols S.A公司）及配套ABO-Rh血型确认卡（DG Gel Confirm卡）、中性卡（DG Gel Neutral卡）、抗球蛋白卡（DG Gel Coombs卡）。ABO反定型细胞、抗H抗体、筛选细胞均购自上海血液生物医药有限责任公司。DNA纯化试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂（日本Takara公司），C1000 Touch Thermal Cycle PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 采集本例患儿的静脉血，乙二胺四乙酸二钾抗凝，抽提DNA，置于-20 ℃保存。

1.3.2 血清学试验 采用微柱凝胶法进行ABO血型鉴定、直接和间接抗球蛋白试验、抗体筛查试验。

1.3.3 基因分型试验 抽提患儿全血样本中的基因组DNA，采用PCR扩增ABO基因增强子、启动子、第1～7号外显子及其相邻的内含子区域序列。参照美国国立生物信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）GenBank（https：//www. ncbi. nlm. nih.gov / gene /? term=ABO）中ABO基因序列设计引物，见表1。扩增体系为Taq DNA聚合酶（5 U/μL）12.5 μL、引物（10 mmol/μL）各1 μL、待测DNA 1 μL、ddH2O 9.5 μL，总反应体系25 μL。扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s、64 ℃退火30 s、72℃延伸45 s，35个循环；72℃ 5 min。PCR产物由上海华大基因公司进行测序。测序结果与血型基因数据库进行比对，以标准序列（A101）判断患儿的血型基因型。

表1 ABO血型基因分型扩增及测序引物序列

2 结果

2.1 血清学结果

ABO血型鉴定和抗球蛋白试验结果显示：患儿血型表型为Aweak型，其父为A型，其母为B型。见表2。

表2 血清学血型鉴定和抗球蛋白试验结果

2.2 ABO血型基因分型结果

扩增患儿及其父母ABO基因第1～7号外显子、增强子和启动子区，将测序结果与A101等位基因标准序列进行比对，对照ABO血型基因数据库进行分析，发现患儿3号外显子存在106G＞T变异，4号外显子存在188G＞A、189C＞T变异，6号外显子存在261delG缺失和297A＞G变异，其余外显子未见异常，A等位基因增强子CBF/NF-Y微卫星区存在4个43 bp串联。患儿父亲6号外显子存在261delG缺失，7号外显子存在467C＞T变异，其余外显子、增强子和启动子区未见异常，通过与血型基因数据库进行比对，确定其基因型为A102/O01。患儿母亲3号外显子存在106G＞T变异，4号外显子存在188G＞A、189C＞T变异，5号外显子存在220C＞T变异，6号外显子存在261delG缺失和297A＞G变异，7号外显子存在526C＞G、646T＞A、657C＞T681G＞A、703G＞A、771C＞T、796C＞A、803G＞C、829G＞A、930G＞A和1096G＞A变异，其余外显子、增强子和启动子区未见异常，通过与血型基因数据库进行比对，确定其基因型为B101/O02。见表3、图1和图2。

表3 血型基因分型结果

图1 本例患儿第1～7号外显子基因测序结果

图2 患儿增强子区测序结果

3 讨论

人类红细胞ABO血型是目前最具临床意义的血型系统，血型血清学技术虽然相对较完善和标准化，但只能鉴定表型，在鉴定某些异常表达的个体和分析遗传学规律时受到限制，疑难标本不易准确鉴定血型。当正反定型不能产生ABO抗原与抗体的互补结果时，排除技术上可能发生的错误后，还需要考虑细胞抗原表位的变异情况，可采用基因分型技术对这些ABO疑难血型标本进行基因测序，明确血型基因型，分析抗原变异的原因。

有研究结果表明，ABO血型基因型和表型直接相关[4-6]，大多数遗传变异表现为1个或多个单核苷酸突变，这些变化在基因水平上可以分布在ABO基因的整个编码区，其中E6、E7尤为多见，导致编码的氨基酸改变，从而使A抗原或B抗原的表达减弱，甚至完全不表达。然而，有一部分抗原变异的患者在ABO基因外显子区域并未找到可能的变异位点，进一步对ABO基因调控区增强子、启动子及其相邻的内含子区域序列的研究发现，调控区序列对ABO血型抗原的表达亦存在影响[7-8]。

ABO基因的转录受调控区影响，其中包括引导转录开始信息的启动子区域及位于ABO基因上游约3.8 kb的增强子区域[7]。这段增强子区域包含了1个由43 bp的重复片段组成的微卫星序列，这个片段与调控ABO的转录密切相关[8]。常见的ABO等位基因有着不同数量的43 bp重复片段，呈现多态性。A1基因只有1个43 bp的重复序列，即5'-ACCCCAGCCAATAGGGGAAGGACACAGAAACAGAAACTGCATT-3'，这个重复序列的第nt41位为A；B基因和部分O01等位基因在此区域为4个43 bp长度的重复序列，各序列第nt41位均为G，即5'-ACCCCAGCCAATAGGGGAAGGACACAGAAACAGAAACTGCGTT-3'；大部分的O01和O02等位基因在此区域也为4个43 bp长度的重复序列，但不同的是，其第1个重复序列的第nt41位为C，即5'-ACCCCAGCCAATAGGGGAAGGACACAGAAACAGAAACTGCCTT-3'；另外3个重复序列的第nt41位均为G，即5'-ACCCCAGCCAATAGGGGAAGGACACAGAAACAGAAACTGCGTT-3'[9]。

本例患儿血清学血型鉴定结果为Aweak，外显子编码区未发现新的突变位点，而位于调控区的增强子区域存在异常变化。家系调查结果显示，患儿父亲基因型为A102/O01，母亲基因型为B101/O02，分析发现本例患儿父亲的A102和O01基因在第7号外显子处发生了交换，使患儿A等位基因和O等位基因都发生了变化，从而产生了新的序列。同时基因重组还导致了调控区增强子微卫星区域发生改变。本例患儿外显子编码区未发现各亚型的特异变异位点，也未发现新的突变位点，因此其抗原变异并不是由ABO编码区外显子变异导致的，而是由调控区增强子微卫星区域发生改变导致的。

ABO基因增强子测序结果显示，本例患儿A等位基因增强子CBF/NF-Y微卫星区为4个43 bp的重复串联序列，其第1个串联序列的第nt41位为C，另外3个串联序列的第nt41位均为G。而正常A等位基因增强子CBF/NF-Y微卫星区只有1个43 bp的串联，其第nt41位为A。有研究认为，ABO基因的转录受CCAAT结合因子CBF/NF-Y微卫星序列的影响[10-11]。不同串联拷贝数呈现不同的特点，A抗原的正常表达有赖于完整的1个43 bp串联CBF/NF-Y微卫星序列，而B抗原的正常表达有赖于完整的4个43 bp串联CBF/NF-Y微卫星序列[12]。本例患儿正是由于基因重组导致A等位基因增强子特征消失，出现类似O等位基因的特征，从而表现为A抗原弱化。THURESSON等[13]也报道过与本例患儿相似的病例，是由基因重组导致的增强子改变。另外，还有各种增强子微卫星序列不同串联拷贝数引起血型弱表达的报道[8，14]。目前，对于微卫星序列串联拷贝数与基因转录活性的研究不多，但可以肯定的是，CBF/NF-Y微卫星序列与ABO抗原表达间确实有相关性，但其真正的作用机制目前尚不明确。由此可见，本例患儿的A抗原弱表达现象很有可能是由于其增强子区CBF/NF-Y微卫星序列发生重组引起串联拷贝数异常所致。

ABO抗原弱表达是目前输血研究的热点，调控区变异引起抗原弱化的现象已逐渐被人们所认识，本研究可为今后抗原弱化机制的研究提供一定帮助。