光合作用放氧反应＊

张纯喜

中国科学院化学研究所 光化学实验室，北京 100190

光合作用放氧反应是植物光系统II(PSII)的特有功能，它是地球上最重要的能量和物质转换过程之一[1-4]。通过光合放氧反应，植物源源不断地从水中获取电子、质子，同时释放出氧气。对光合放氧反应微观本质的研究不仅具有重要的科学意义，同时也对探索人工高效利用太阳能，解决人类面临的能源危机、环境污染和温室效应问题具有潜在的应用价值[5-6]。

1 光系统II结构和光能转换

光合放氧的自然现象早在250年前就被英国科学家发现，经过生物学家、化学家和物理学家的长期努力，目前人们对光合放氧的认识已经从宏观进入到微观分子-原子层次[7-8]。在21世纪初，得益于使用嗜热蓝藻的PSII生物样品，人们在PSII放氧复合体的晶体学方面取得了突破[9-13]。2001年Zouni等人[9]首次报道了从嗜热蓝藻中分离的PSII放氧复合体的3.8 Å分辨率的晶体结构；2004年Ferreira等人[10]报道了3.5 Å分辨率的PSII晶体结构，解析出PSII中大部分蛋白和色素分子的空间结构，并辨别出光合作用放氧中心(OEC)是一个Mn4CaO4簇合物。2011年Umena等人[11]报道了1.9 Å高分辨率的PSII晶体结构(图1(a))，首次揭示出OEC的详细结构，该工作是半个世纪以来光合放氧研究领域中最重要的进展。

PSII通常以二聚体形式存在，每个单体拥有20多个蛋白质亚基(如D1、D2、CP43、CP47、PsbO等)，其整体结构如图1(a)所示[11,14]。PSII核心含有4个叶绿素分子、2个去镁叶绿素分子、2个质体醌分子(QA、QB)、1个非血红素Fe离子(与4个组氨酸的咪唑环和1个HCO3-/CO32-配位)，它们排布成近似左右对称的两条电子转移链(图1(b))。PSII核心色素分子被光激发后，发生原初电荷分离，产生正离子自由基(P680＋•)和负离子自由基 (Pheo-•)[15-16]。其中：Pheo-•具有很强的还原性(还原电位为－0.42 V)，它推动受体侧非血红素Fe催化质体醌QB的还原反应；P680＋•具有很高的氧化性(氧化电位可达+1.25 V)，它驱动放氧中心(OEC)催化水氧化反应[2]。

图1 PSII整体结构(a)和核心辅基空间排布(b)

TyrZ和QA是PSII中担负调控快速原初光化学反应(单电子反应)和缓慢催化反应(包括给体侧四电子、四质子的水催化氧化反应和受体侧两电子、两质子的醌催化还原反应)的两个关键枢纽[17-18]。前期我们借助于液氦温度电子顺磁共振(EPR)技术，通过原位诱导、原位探测的方法在具有放氧活性的PSII样品中同时成功探测到TyrZ和QA中间体(TyrZ•和QA-•)EPR信号[19-21](图2)，并提出它们通过两种氢键调控光系统II两侧电子转移和催化反应的机理模型[6,18,22](图3)。

图2 活性PSII中 TyrZ•和QA-•的EPR信号

如图3所示，给体侧(左侧)TyrZ与His190之间氢键强度经历“强→弱→强”变化[22]，受体侧(右侧)QA与His214之间氢键强度经历“弱→强→弱”变化[23]。由于强氢键向弱氢键转变过程中可产生10～20 kcal/mol的能量变化[24-25]，这种氢键强度的可逆变化可以有效稳定高活性电子转移中间体。PSII两侧的氢键强度可逆变化能保证电子源源不断地从给体侧向受体侧传递，避免电子逆向传递，从而防止电荷复合的发生，维持PSII高效的光能转换[6]。

图3 PSII中氢键调控光反应和催化反应的机理模型

2 光合作用放氧催化中心

OEC是PSII最关键的组分，它也是自然界唯一能高效、安全地将水裂解，释放出电子、质子和氧气的生物催化剂[14,26-27]。OEC结构和催化原理一直是光合作用领域最受关注的研究热点和难点。早在40多年前人们就知道OEC的核心由4个Mn离子和1个Ca离子组成[28-29]。20世纪末，人们依据EPR、EXAFS(扩展X射线吸收精细结构)等光谱测定和理论计算提出了多种OEC的结构模型[30-33]。1999年我们团队提出了如图4(a)所示的OEC结构模型[34]，首次提出关键辅基Ca离子位于OEC的中心，它通过3个氧桥(µ-O)、2个羧基与4个Mn离子结合。

图4 OEC的结构模型(a)和晶体结构示意图(b)

2011年Umena等人[11]报道了1.9 Å分辨率的PSII晶体结构，首次揭示出OEC核心骨架及其配体环境的详细结构信息(图4(b))。OEC的核心骨架中4个Mn离子和1个Ca离子通过5个µ-O连接成1个不对称的Mn4CaO5簇。OEC的外围配体由6个羧基、1个咪唑环和4个水分子提供。在此结构中，Ca离子通过3个µ-O桥、2个羧基与4个Mn离子结合，这一结构特征证实了我们1999年提出的OEC结构模型[34]。

OEC在催化放氧过程中经历5种不同的状态(S0、S1、S2、S3、S4态)[26,35-36](图5)。其中：S0态是起始态；S1态是黑暗稳定态；S2和S3态为高氧化态；S4态是一个瞬态，它能够结合水分子并很快释放氧气恢复到S0态。在此催化循环过程中，伴随着电子、质子的转移和释放，4个Mn离子的价态和OEC自身空间结构都会发生变化。OEC中4个Mn离子的价态[26,37]分别是S0(＋3、＋3、＋3、＋4)或(＋2、＋3、＋4、＋4)、S1(＋3、＋3、＋4、＋4)、S2(＋3、＋4、＋4、＋4)、S3(＋4、＋4、＋4、＋4)。由于在实验中难以捕捉S4，目前S4态中锰离子的价态仍然未知。图4(b)给出的是S1态OEC的结构。近几年，S0、S2、S3态的OEC结构也陆续有报道[38-41]，但实际测试样品中混有多种不同状态的OEC，导致结构分析和指认困难，同时在结构测试过程中X射线对OEC结构有破坏作用，导致这些结构仍然存在不确定性[8,42-43]。最近人们依据S1态OEC的结构和理论计算提出了多种光合放氧机理模型[7,38,44-50]，但尚无一种被广泛认可[8]。目前光合放氧机理方面有许多重要的科学问题仍有待研究。例如：①O-O键如何形成？②Ca离子如何发挥作用？③底物水分子的结合位点在哪？④OEC的构型如何变化？对于这些问题的回答将是今后光合放氧研究的重点。

图5 OEC催化放氧反应过程中锰离子的价态变化及电子、质子释放示意图

3 光合放氧中心的生物合成

OEC的催化功能与其自身特殊结构密切相关，也与PSII的蛋白环境密切相关。在PSII中，OEC主要结合在D1蛋白亚基上。大量研究显示，在日照条件下D1蛋白会发生光破坏而丧失功能，而光合生物为维持有效安全的光能利用，受到破坏的D1蛋白会不断地被新合成的D1蛋白所替代[51-53]。通常在日照条件下D1蛋白的寿命只有约30 min[54]。伴随着旧的D1蛋白降解和新的D1蛋白重组，OEC也经历着降解和再合成[51](图6)。PSII的外周蛋白(蓝藻中为PsbO、PsbV、PsbU；高等植物及真核藻类为PsbO、PsbQ、PsbP)在稳定OEC方面发挥重要作用[55]。特别是PsbO蛋白，其解离会使OEC暴露于水相环境，导致OEC很快解离成游离Ca2+和Mn2+。光系统II核心蛋白和OEC的降解和修复过程如图6所示。

图6 PSII核心蛋白和OEC的降解与组装原理图

因为OEC的组装需要光的参与，所以OEC的组装过程又被称为光组装(photo-assemble)或光活化(photo-activation)过程[56]。OEC能进行组装的前提条件是PSII蛋白框架(主要包括D1、D2、CP43、CP47、Cytb559、PsbO等)能够提供一个可接纳OEC的微环境 (如图7所示)。得益于分子生物学[57-58]和不同PSII样品(包括具有放氧活性的PSII、OEC缺失的PSII、OEC组装前PSII样品)的结构解析[11,59-61]，人们发现OEC的微环境存在6～7个羧基、2～3个咪唑环残基和水分子，呈弱酸性(pH为5～6)。组装前的PSII被称为Apo-PSII。Apo-PSII结合游离Mn2+和Ca2+，在光驱动下，Mn2+被逐步氧化为高价锰离子(Mn3+/Mn4+)，最终形成Mn4CaO5簇合物。由于难以获得OEC组装中间体的确切结构信息，目前人们对OEC组装机理的认识还非常有限，远未达到在分子-原子层次阐明OEC的组装规律[54,62-63]。此外，需要说明的是，通常OEC的组装研究都是在体外进行，而体外组装所得PSII放氧活性均显著低于正常生理条件下PSII的放氧活性[62]，因此体外OEC组装实验能否准确反映光合生物体内OEC的组装规律仍然是个悬而未决的问题。

图7 光合生物中OEC所处的蛋白微环境

在生理条件下，OEC的降解和组装时刻都在发生，因此OEC核心骨架和配体环境除了要满足高效、安全地催化水氧化的功能外，还必须满足OEC降解和组装两个过程都能有效和安全地进行。这就要求OEC自身的结构不能太稳定，否则无法有效降解；同时OEC的合成条件不能太苛刻，过程不能太复杂，否则无法快速合成。由此可见，在探讨OEC各组分的结构和功能关系时，不仅要考虑它们在水氧化过程中的作用，同时也需要考虑其在OEC降解和组装过程中所发挥的作用。

4 光合放氧中心的人工合成

人工合成光合作用OEC，以取之不竭的太阳能驱动水裂解来获取清洁能源(氢能或电能)，被认为是解决人类社会面临的能源危机、环境污染和温室效应问题的理想途径。这方面的研究具有重要的科学意义和应用价值，同时也是广受关注的重要科学前沿[3,5,14,64]。

光合作用OEC的空间结构解析为人工合成OEC提供了重要的依据，但如何实现OEC的人工合成却是一个极具挑战性的科学难题，有一系列合成问题需要解决[65-66]。例如：①如何将Ca2+镶嵌在Mn簇中？②如何模拟生物配体环境？③如何合成不对称Mn4CaO5核心骨架？④如何稳定高氧化性的催化中心？

自20世纪末以来，国际上很多研究小组尝试人工合成OEC，并报道了大量含锰簇合物[67-72]。2015年之前人们基本上都局限在对OEC的局部结构特征进行模拟，如何实现对OEC整体结构的模拟则是一个巨大的挑战[65]。我们团队基于对生物OEC的结构和催化机理的长期研究，2014年以来开展了一系列OEC的仿生模拟研究[73-76]，并先后解决了Ca/Sr离子难与Mn簇结合和难以在高价Mn簇中引入生物配体的合成难题。2015年受生物OEC组装的启示，我们首次成功合成出不对称的仿生Mn4CaO4簇合物[77](图8)。

图8 OEC(左)和仿生OEC(右)的结构比较[77]

在仿生Mn4CaO4簇合物中，4个Mn离子和1个Ca离子通过4个μ-O桥构成1个不对称的Mn4CaO4核心骨架，其外围由8个羧酸根阴离子、2个羧酸分子和1个吡啶分子提供配位。仿生Mn4CaO4簇合物中4个Mn离子的价态(+3、+3、+4、+4)与生物OEC(S1态)完全一样(图8)。该化合物被单电子氧化后能够观察到类似于OEC(S2态)样品所拥有的g=2和g=4两种EPR信号[77]。这些结果显示仿生Mn4CaO4簇合物与OEC不仅空间结构上非常类似，而且电子结构也类似。仿生Mn4CaO4簇合物的电化学测定(图9)揭示它也能够进行4个电子的氧化-还原反应，其中S1→S2转变的中电位为+0.8 V，它与OEC对应S1→S2的中电位基本一致。此外，我们还观察到仿生Mn4CaO4簇合物在有少量水(＜1.0%)存在时，能够在电极表面催化水裂解，给出显著的催化电流[77]。这些研究揭示仿生Mn4CaO4簇合物不仅在结构上与OEC类似，而且在理化性能上也与OEC类似。这类仿生Mn4CaO4簇合物的获得为今后研究OEC的结构和催化机理提供了理想的化学模型，同时为今后制备廉价、高效的人工水裂解催化剂奠定了重要的基础[78]。

图9 Mn4CaO4簇合物的氧化还原特性[77]

2019年通过对上述仿生Mn4CaO4簇合物中钙离子上配体的替换，我们成功制备出能够在极性有机溶剂(包括CH3CN、DMF)中可以稳定4～6周的新型Mn4CaO4簇合物[43](图10)。这类新型化合物除钙离子的配体外，其他部分与图8的仿生Mn4CaO4簇合物完全一样，其锰离子的价态也与前期Mn4CaO4簇合物一样。钙离子上2个溶剂分子(如DMF)的引入使仿生Mn4CaO4簇合物与生物OEC的结构更加接近。

图10 两种含溶剂分子的新型仿生Mn4CaO4簇合物[43]

图8和图10仿生Mn4CaO4簇合物的制备、结构和理化性能均说明Mn4CaO4核心是个热力学非常稳定的结构单元，这可能是大自然为什么选择类似簇合物作为光合放氧中心的一个重要原因[79]。但需要特别指出的是，目前我们制备的所有仿生Mn4CaO4簇合物均缺少与OEC中类似的一个µ2-O桥(在仿生簇合物中对应位置被一个羧基桥替代)[80-81]。能否在仿生Mn4CaO4簇合物的Mn3和Mn4之间引入这一µ2-O氧桥将是今后人工合成OEC研究中令人期待的一个研究方向。此外，能否突破生物OEC对Mn离子、Ca离子的依赖性，人工合成更稳定、更高效的仿生OEC同样非常令人期待。这些方面的深入研究不仅能加深我们对自然光合放氧微观本质的认识，同时也会推动人工光合作用的研究进程。

5 结论与展望

综上所述，近年来光合生物的PSII晶体结构研究取得了突破性进展，光合放氧中心Mn4CaO5簇合物的详细结构已被揭示。光合生物的OEC具备三个重要特点：一、正常条件下，OEC能高效、安全地催化放氧反应；二、在PSII的D1蛋白发生破坏时，OEC能被快速降解；三、在PSII的D1蛋白被修复时，OEC能被快速合成。最近我们借鉴OEC的生物组装条件成功合成出结构和理化性能均与OEC类似的系列仿生Mn4Ca-簇合物，为研究OEC的微观原理提供了理想的化学模型。但目前无论自然光合放氧研究，还是人工光合放氧研究都还有许多科学问题亟待解答，它们包括：①生理条件下OEC的组装规律；②OEC催化放氧的机理；③能否借鉴OEC的结构，发展稳定、高效、廉价的仿生水裂解催化剂？④能否构建高效人工光驱动水裂解体系，获取清洁能源(氢能或电能)？对这些问题的深入研究将会有助于人们对自然光合放氧反应微观本质的认识，同时也会推动人工光合作用利用太阳能裂解水来获得清洁能源(电能或氢能)的研究进程。

致谢 研究工作受到国家自然科学基金(31770258、91961203)的资助；感谢陈长辉博士和姚若青同学在稿件准备中提供的帮助。