火麻仁油及大麻二酚对抑郁模型小鼠行为及炎症反应的影响

王语聪，谢智鑫，李春雨，王宇晴，陈晓伟，韩建春,2,

(1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.黑龙江省绿色食品科学研究院，黑龙江哈尔滨 150028)

火麻仁又称大麻仁，是大麻(Cannabis sativaL.)果实干燥成熟种子，为药食同源物质，其富含植物蛋白、膳食纤维及多元不饱和脂肪酸，因其含有丰富的碳水化合物，可为机体提供能量，被广泛用作食品的辅料及动物饲料[1]。药典记载为润肠通便药材，有较好的润燥通便效果[2]。火麻仁油作为火麻仁常见的加工产品之一，因其内含有大量不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸和α-亚麻酸等不饱和脂肪酸，因此具有降血脂[3]、抗氧化[4]和改善记忆[5]等功效，被大多数人作为典型的药食同源物及养生食材、临床用药材。大麻二酚(cannabidiol，CBD)作为火麻仁油中的酚类物质之一，在火麻仁油中约占5 mg/kg[6]。火麻仁油的营养特性与多不饱和脂肪酸含量有关，且主要与CBD的存在有关[7]。临床研究表明，CBD可快速透过血脑屏障，可作为一种由压力引起的神经系统疾病治疗药物[8]，有效地治疗关节炎、多发性硬化症、慢性疼痛、精神分裂症和癫痫，近年被广泛应用于医疗[9-12]。Sartim等[13]通过小鼠强迫游泳实验的结果表明，CBD能够降低小鼠静止不动的时间，首次证实其可能具有抗抑郁作用。但是对于CBD来源物质——火麻仁油能否减轻抑郁症的方面未见有研究报道。

抑郁症的形成原因十分复杂，研究证实抑郁症与炎症因子存在密切关系[14]。为了探寻作为食品的火麻仁油对神经系统的保护作用，本研究从火麻仁油中提取其有效成分CBD，以慢性不可预测的轻度应激(Chronic unpredictable mild stress，CUMS)模型小鼠为受试对象，通过连续灌胃给予小鼠火麻仁油和CBD 8周，观测小鼠的焦虑症状、学习和认知行为，检测小鼠海马及皮层炎症因子mRNA表达量及显微观察，探究火麻仁油和CBD能否缓解小鼠的抑郁行为和神经系统炎症反应，旨在火麻仁油在药食同源开发和利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

3周龄C57BL/6雄性小鼠(合格证：No.110324 1911) 西安交通大学医学实验动物中心；火麻仁 黑龙江(孙吴)火麻产业园，产品安全及其质量要求均符合国家相关规定，火麻仁油由传统压榨技术获得；CBD 由实验室制取，采用柱料A:Seplite LX-100B，粒子尺寸0.4～1.2 mm、柱料B:Seplite LXBC02，粒子尺寸50～100 μm，通过APPS MV全自动层析纯化系统从火麻仁油中分离纯化得到，纯度99%以上；CBD标准品 美国SIGMA-ALDRICH公司；mRNA提取试剂盒、反转录试剂盒、RTPCR试剂盒 中国宝生物工程有限公司；DAB显色 北京中山金桥生物技术有限公司；IBA-1抗体和二抗 美国Abcam公司。

离心机 赛默飞世尔科技(中国)有限公司；QuantStudio 3D型数字PCR仪 美国Life Technologies公司；光学显微镜 日本奥林巴斯公司；高架十字迷宫 上海欣软信息科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及干预 将3周龄雄性C57BL/6小鼠于22±2 °C、湿度50%±10%下，自由采食和饮水，12 h光/暗周期进行为期2周的适应性喂养。所有的试验步骤遵循试验动物护理以及动物协议，由西安交通大学动物伦理委员会批准[15]。将全部喂食标准饮食(AIN-93M)并分成五组，每组10只。CBD低剂量组(浓度为15 mg/kg)、CBD高剂量组(浓度为30 mg/kg)、火麻仁油组(剂量3 mL/kg，液相色谱分析可知CBD的浓度为4.7 mg/kg)均溶解于橄榄油中，以10 mL/kg/d剂量进行灌胃，并同时暴露于慢性不可预测的轻度应激(Chronic unpredictable mild stress，CUMS)程序；模型组按照上述剂量灌胃等体积的橄榄油，并暴露于CUMS程序；空白组仅灌胃等体积的橄榄油。其中CBD剂量的选择是根据Shoval等[16]探究CBD对于抑郁模型小鼠的享乐效用中效果较好的剂量浓度选取15、30 mg/kg。火麻仁油剂量的依据是李根林等[17]探究火麻仁油对D-半乳糖衰老小鼠模型的研究中选取3 mL/kg以及魏月媛等[18]探究火麻仁油毒理学采用90 d大鼠亚慢性毒性实验，结果表明在实验期间动物一切正常无不良反应，说明火麻仁油不具有亚慢性毒性。

在两周适应性喂养后，除空白组外，进行CUMS程序[19]。其程序为：每周给予小鼠7种(S1～S7)不同刺激。S1：1 min悬尾(距尾尖1 cm)；S2：光照(24 h)；S3：倾斜笼子(30 °)；S4：禁食(24 h)；S5：禁水(24 h)；S6：湿垫料(200 mL纯净水)；S7：冷水游泳(4 ℃、5 min)。每周随机且不重复选择刺激方式的顺序。

各分组小鼠于每日刺激前30 min进行灌胃，直到8周后CUMS处理程序结束时为止，试验期间小鼠自由采食和饮水。在最后两周进行多种行为学测试，且测试在给药后1 h进行，以确定压力模型成功建立。在行为测试后处死小鼠，并用氯水合物诱导麻醉，取眼球血和脑部组织，分离纹状体、脑海马、前额皮质组织等，保存于-80 °C冰箱中，备用。所有手术均处于麻醉状态，并尽一切努力使疼痛最小化。

1.2.2 小鼠抑郁行为测试

1.2.2.1 蔗糖偏好测试 蔗糖偏好测试反映小鼠的愉悦感。在建模成功后第1 d对小鼠进行为期3 d蔗糖偏好适应性训练，其中第1 d为两瓶纯净水，第2 d将其中一瓶更换为1%的蔗糖水，第3 d进行为期24 h禁食后蔗糖偏好实验，放置两瓶分别为1%蔗糖溶液和纯净水的等量溶液，经过24 h后记录两瓶溶液的消耗量并进行计算，公式如下：

蔗糖偏爱程度(%)=糖水消耗量/(糖水消耗量+普通水消耗量)×100

1.2.2.2 强迫游泳测试 强迫游泳是根据小鼠的静止时间从而反映小鼠的绝望程度[20]。在建模成功后第2 d进行强迫游泳实验，总时长为6 min，用摄像系统记录动物在实验后的4 min内保持不动时间。实验结束后将小鼠吹干后放回笼中。

1.2.2.3 悬尾测试 悬尾测试是为了反映小鼠的焦虑程度[21]。在建模成功后第3 d进行测试。在用固定贴纸将小鼠尾尖部2 cm处固定于悬尾箱顶部，将小鼠身体调整至倒立状态，使其头部距离箱底部50 cm左右，总时长为6 min，用摄像系统记录动物在实验的后3 min内保持不动时间。为避免外环境所带来的实验误差，整个记录过程需要小鼠一直处于观察不到操作人员的状态。

1.2.3 小鼠焦虑行为测试

1.2.3.1 旷场测试 旷场测试是为了反映小鼠在陌生环境中的自主性和探索能力[20]。在运动监测笼中使用带红外传感器的数字计数器测量小鼠的自发活动。建模成功后第4 d进行，将每只小鼠放置在设备的中心并允许自由探索5 min。整个过程都进行了视频记录，稍后通过前面提到的计算机化视频跟踪系统分析总距离和线路交叉总数(运动活动)进行分析。每只小鼠进行测试后，清理排泄物并用酒精擦拭以便气味带来实验偏差。

1.2.3.2 高架十字迷宫测试 高架十字实验也是反映小鼠焦虑程度的一种测定方法[22]。建模成功后第5 d进行实验，小鼠在视频监控下自动移动，利用设备和相关软件记录数据，例如小鼠的移动路线、速度、总距离和臂数。每只小鼠的测试时间为5 min，测试结果基于小鼠张开双臂停留的时间和距离。

1.2.4 小鼠学习认知行为测试

1.2.4.1 Y迷宫测试 Y迷宫主要是探索小鼠的记忆能力[23]。建模成功后第6 d进行小鼠在视频监控下自动移动，利用设备和相关软件记录数据，例如其移动路线、速度、总距离和臂数。每只小鼠的测试时间为5 min，计算结果为交替百分比：

交替百分比(%)=不重复进入三个交叉臂的总次数/(进臂总次数-1)×100

1.2.4.2 新物体识别测试 新物体识别是反映小鼠的学习认知能力[24]。建模成功后第7 d将小鼠放在一个开放的立方体箱中央，该立方体箱长40 cm、宽40 cm、高50 cm。实验分为适应期、训练期和测试期。小鼠在视频监控设备下自由移动，记录数据。在实验测试期间，酒精鼠标盒和物体的气味被用来防止实验数据错误。

1.2.5 脑部皮层和海马mRNA提取和检测 用Trizol抽提法[25]提取脑组织中总RNA并用逆转录酶PrimeScriptTM RT合成cDNA，然后进行PCR扩增。通过SYBR green PCR试剂盒测量mRNA表达，并使用CFX96TM系统进行实时检测。两步PCR扩增的标准程序：95 ℃ 30 s，循环1次；95 °C 3 s；60 °C 30 s循环40次；进入溶解曲线阶段。小鼠源前后端引物示如表1。用GAPDH的mRNA作为内参，2-ΔΔCt计算基因相对表达量。

表1 半定量RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for semi-quantitative RT-PCR analysis

1.2.6 海马组织切片的病理学观察 小鼠在处死后立即取出脑组织，取左脑并将其固定在4%(v/v)PBS固定剂中24 h，脱水后包埋于石蜡中进行切片。将切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后用梯度乙醇水化，并用PBS洗涤5次，每次4 min。为防止特异性染色，通过添加含有3%的过氧化氢去离子水处理10 min，使内源酶活性失活，然后与一抗孵育过夜。用PBS洗涤5次后，加入辣根酶标记链霉卵蛋白素工作液孵育20 min，然后加入DAB工作液进行显色反应10 min。切片用苏木精复染。将切片在梯度乙醇中脱水后，在二甲苯中澄清，树脂密封，并在光学显微镜观察(200×)上观察。

1.3 数据处理

Iamge J软件处理图像，Graphpad Prism8、IBM SPSS Statistics 20软件分析相关数据。实验数据表示为平均值±标准误差(Mean±SEM)，并且每个实验独立重复至少3次，P<0.05为显著，P<0.01为极显著。

2 结果与分析

2.1 火麻仁油和CBD对模型小鼠抑郁行为学的影响

如表2所示，在悬尾实验中，与空白组相比，模型组静止不动时间显著上升(P<0.05)，与模型组相比，CBD低、高剂量组分别极显著(P<0.01)、显著(P<0.05)低于模型组小鼠的静止不动时间，但火麻仁油剂量组无差异性显著(P>0.05)。根据强迫游泳的数据分析，与空白组相比，模型组小鼠静止不动的时间显著延长(P<0.05)；与模型组相比，CBD剂量组均极显著低于模型组(P<0.01)，但火麻仁油剂量组无差异性显著(P>0.05)。通过蔗糖偏好数据可知，与空白组相比，模型组小鼠喜爱蔗糖程度显著降低(P<0.05)；与模型组相比，火麻仁油剂量组和CBD低剂量组显著升高(P<0.05)，CBD高剂量组极显著升高(P<0.01)。

表2 各组小鼠抑郁行为学指数Table 2 Behavioral index of mice in each group

抑郁症的主要表现为情绪低落、兴趣丧失、活动减少、饮食和思维的改变等[26]。经过八周建模，蔗糖偏好表明小鼠愉悦感的获得和丧失程度，抑制小鼠糖水偏好度降低。悬尾实验和强迫游泳表明小鼠在紧张的环境下产生的抑郁与绝望状态。通过实验可以看出，火麻仁油和CBD剂量组的小鼠均能够增加小鼠对糖水的喜爱程度，且CBD剂量组能够减少静止不动的时间，证明火麻仁油及CBD能够改善CUMS模型小鼠抑郁行为。

2.2 火麻仁油和CBD对模型小鼠焦虑行为学的影响

根据高架十字迷宫开放臂与闭合臂时间比和路程比数据(表3)可得，与空白组相比，模型组极显著下降(P<0.01)；与模型组相比，CBD剂量组均极显著上升(P<0.01)，但火麻仁油组不存在显著差异(P>0.05)。

表3 各组小鼠焦虑行为学指数Table 3 Behavioral index of mice in each group

高架十字迷宫是评价动物焦虑反应的一种行为学实验方法，利用动物对环境改变的特性探究和对高悬敞开臂的心理来形成小鼠的焦虑程度。旷场测试是为了增加小鼠自主神经活动和探索能力[27]。本实验可知，与模型组相比，CBD剂量组高架十字迷宫开放臂与闭合臂的时间比和路程比有极显著的上升(P<0.01)；旷场实验跨格数没有显著差异(P>0.05)，与Zanelati等[28]探究CBD对小鼠的抗抑郁作用的结果相一致。因此，CBD能够改善CUMS模型小鼠的焦虑行为，效果好于火麻仁油组。

2.3 火麻仁油和CBD对模型小鼠认知学习能力的影响

在新物体识别分辨指数实验中(结果见表4)，与空白组相比，模型组显著下降(P<0.05)；与模型组相比，火麻仁油组显著升高(P<0.05)，CBD剂量组极显著升高(P<0.01)。通过Y迷宫数据可知，与空白组相比，模型组显著下降(P<0.05)；与模型组相比，火麻仁油组不存在显著差异(P>0.05)，但CBD剂量组均显著上升(P<0.05)。

表4 各组小鼠认知学习能力指数Table 4 Behavioral index of mice in each group

抑郁症作为重要神经类疾病，其发病机制很复杂，慢性不可预测的轻度压力模型常用于研究病理及生理机制和抗药的作用机制[29]。新物体识别和Y迷宫表达了认知行为和学习能力。在认知和学习能力方面，CBD剂量组明显优于火麻仁油组。综上，相比于火麻仁油可改善由抑郁症带来的认知、焦虑及学习行为，CBD有更强的作用。

2.4 小鼠皮层炎症因子含量变化

如图1所示，与空白组相比，模型组肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1β)水平均极显著上升(P<0.01)；诱导NOS(iNos)mRNA水平均显著上升(P<0.05)。与模型组相比，CBD剂量组TNF-α、iNos和IL-1β均显著降低(P<0.05)，火麻仁油组IL-1β水平显著下降(P<0.05)，火麻仁油组TNF-α、iNos水平无显著差异(P>0.05)。

图1 各组小鼠皮层TNF-α、iNos、IL-1β的mRNA水平(n=10)Fig.1 The mRNA levels of TNF-α, iNos and IL-1β in the mouse cortex of each group (n=10)

炎症因子在免疫系统中发挥重要作用，当免疫系统被激活时，免疫细胞会分泌多种炎症细胞因子，作为免疫应答及炎症效应因子，诱导炎症发生；IL-1β、TNF-α和iNos可以作为炎症反应调节因子，在炎症中发挥中心作用，当免疫细胞被激活时释放，脑部中其含量增加，引起神经细胞损伤[30]。研究表明，火麻仁油及CBD可以显著降低巨噬细胞产生的TNF，从而降低炎症；李萃萃等[31]研究证实CBD能够抑制脊髓损伤模型小鼠的炎症反应，进而对脊髓神经功能起到保护作用。本试验结果表明，小鼠皮层IL-1β、TNF-α及iNos的mRNA水平明显降低，说明火麻仁油及CBD能够改善小鼠脑神经的炎症状态，与前人的研究结果相符。

2.5 小鼠海马炎症因子含量变化

如图2所示，与空白组相比，模型组TNF-α、iNos和IL-1β均极显著升高(P<0.01)；与模型组相比，CBD剂量组TNF-α、iNos和IL-1β均显著降低(P<0.05；P<0.01)，火麻仁油组IL-1β显著下降(P<0.05)，火麻仁油组TNF-α、iNos无显著差异(P>0.05)。

图2 各组小鼠海马TNF-α、iNos、IL-1β的mRNA水平(n=10)Fig.2 The mRNA levels of TNF-α, iNos and IL-1β in the hippocampus of each group of mice (n=10)

炎症因子与抑郁症的发病机制密切相关，这些炎症因子进入大脑，影响与情绪情感调节有关的神经递质，从而产生抑郁症状[32]。近年来，研究人员发现炎症因子在抑郁症的发病过程中发挥重要作用，促炎因子显著上调。越来越多的证据表明，抗炎药物治疗后抑郁症状明显改善，促炎因子水平明显降低。Li等[33]研究表明通过LPS诱导小鼠使其产生抑郁样行为，经抗抑郁药物氟西汀治疗后，促炎因子IL-1β和TNF-α含量均有显著降低。Shelton等[34]采用微阵列分析对未治疗的抑郁患者死后脑组织进行研究表明，患者前额叶脑组织中的促炎因子和抗炎因子的表达量均有增加。本试验结果表明，在小鼠脑部海马部分，CBD剂量组中IL-1β、TNF-α及iNos的mRNA水平有着显著降低(P<0.05)，同时抑郁小鼠的认知功能得到改善，结合前人的研究结果，说明火麻仁油及CBD可能通过抑制神经炎症反应，来改善其认知功能。

2.6 小鼠星形胶质细胞的表达

星形胶质细胞是脑部中主要的炎症细胞之一，其活化程度反映了大脑中炎症反应的状态。如图3所示，相对于空白组，模型组的小鼠海马区星形胶质细胞表达增加；与模型组相比，火麻仁油和CBD剂量组星形胶质细胞表达相对减少。由此可知，CBD抑制了小鼠海马脑区星形胶质细胞的活化。

图3 各组小鼠海马CA1、CA3、DG和Cortex区域IBA-1的形态变化Fig.3 The morphological changes of hippocampus CA1, CA3, DG and Cortex IBA-1 in each group of mice

小胶质细胞的离子化的钙结合衔接分子1(IBA-1)是一种保护胶质细胞的钙类结合蛋白[35-36]，在脑部主要起到调节细胞因子及炎症的作用，参与神经和免疫功能[37]。由图3中可明显看出，CBD和火麻仁剂量均能降低IBA-1表达量，但CBD的剂量效果比火麻仁更好，说明火麻仁及CBD均能有效缓解小鼠海马炎症状态。

3 结论

火麻仁油能够提高模型小鼠抑郁行为及认知能力，并且降低小鼠皮层和海马炎症因子iNos mRNA水平；CBD能改善CUMS模型小鼠的抑郁和焦虑行为，提升其学习和认知功能，抑制小鼠脑皮层和海马的炎症反应。因此，本试验证明火麻仁油中的CBD具有改善抑郁症状的潜力。