不同冻结方式对沙光鱼品质的影响

胡馨月，张 维，赵 行，李若敏，周 振，刘 冰，张梦雪，盘赛昆,2,3,4,

(1.江苏海洋大学食品科学与工程学院，江苏连云港 222005；2.江苏省海洋生物技术重点建设实验室，江苏连云港 222005；3.江苏省海洋生物资源与环境重点实验，江苏连云港 222005；4.江苏省海洋资源开发研究院，江苏连云港 222005)

沙光鱼(Synechogobius hasta)，学名“矛尾复虾虎鱼”，属虾虎鱼科，分布于太平洋西北部、中国、日本和韩国海域[1-2]，在连云港市沿海分布广，沙光鱼肉质细腻、口感柔润嫩滑，营养丰富，深受消费者的喜爱[3]，有“十月沙光赛羊汤”之说[4]。新鲜沙光鱼的蛋白质和水分含量高，组织蛋白酶的活性较强，捕获后鱼体易死亡，容易腐败变质，不易贮藏，保鲜难度大[5-6]。市场多以鲜售为主，多在每年的秋季和冬季，不能满足顾客全年消费的需求，也影响了沙光鱼作为连云港特产的推广和产业链的发展。因此，需要加强沙光鱼保鲜相关技术的研究，延长货架期。

水产品常用的保鲜方法为冻藏保鲜，一般采用的冻结方式有空气冻结、鼓风冻结、浸渍冻结等[7]。在冻结过程中，冰晶的形成会造成肌肉的机械损伤，发生一系列化学反应，如脂肪氧化、鲜度变化、蛋白质冷冻变性等现象，严重影响冻品的品质和营养价值[5]。研究发现，水产品的冻藏品质与冻结方式、冻结速率有关[8-9]。Cai等[10]发现-55 ℃冻结日本鲈的品质优于-18 ℃冻结；胡亚芹等[9]研究发现液氮速冻比传统冻结方式能更好地保持带鱼的品质；Boonsumrej等[11]比较了斑节对虾液氮浸渍冻结和鼓风冻结的品质，发现液氮浸渍冻结能更好地维持斑节对虾的品质。液氮无色、无味、化学性质稳定是一种理想的制冷剂[12]。具有冻结时间短、品质好、干耗少、杂菌少、无污染等优点，已变成食品领域环保冷冻技术研究的热点[9,13]。液氮速冻能大大降低冰晶对组织结构的破坏，解冻后较好地保持食品原有的色、香、味[14]。目前，国内外已广泛应用液氮速冻于水产品和其他食品的保鲜[15]。研究不同冻结方式对水产品冻藏期间品质的变化，有利于企业选择合适的冻结方式，保证水产品的品质。对于不同冻结方式对沙光鱼冻藏品质的影响研究还未见报道。

本文以沙光鱼为原料，采用三种冻结方式(-80 ℃液氮速冻、-40 ℃送风冻结、-50 ℃静止空气冻结)处理样品并于-18 ℃冰箱贮藏，以TVBN值、K值、盐溶性蛋白含量、Ca2+-ATP酶活、TBA值、蒸煮损失率为理化指标结合冰晶形态和感官评价，研究不同冻结方式对冷冻沙光鱼品质的影响，探索沙光鱼最佳的冻结方法，为沙光鱼的保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜活沙光鱼 体重200～250 g，体长30～35 cm，采购于连云港市海州区菜市场；三氯乙酸、氯化钾、钼酸铵、米吐尔等试剂 均为分析纯，国药化学试剂有限公司。

DW- 40W100医用低温保存箱 青岛海尔股份有限公司；ZY/SDG-100液氮速冻机 无锡中亚环境试验设备有限公司；JJ-2B高速组织捣碎机 金坛市天瑞仪器有限公司；TGL-16G高速台式冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；TP9008U温度记录仪 深圳市拓普瑞电子有限公司；XSP-8CP生物显微镜 上海光学仪器厂；KD-BM生物组织包埋机 浙江金华市益迪医疗设备有限公司；YD-1508B石蜡切片机 浙江金华市益迪医疗设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 冻结方法 将新鲜沙光鱼用水冲洗干净并沥干，随机分为3组。分别进行如下冻结处理[16]，静止空气冻结：将沙光鱼置于-50 ℃冰箱中进行冻结；送风冻结：将沙光鱼置于-40 ℃鼓风冻结机中进行冻结；液氮速冻：将沙光鱼置于-80 ℃液氮速冻机中进行冻结。将温度探头插入沙光鱼中心位置，当样品的中心温度达-18 ℃时取出，将冻结好的沙光鱼装入自封袋，封口，于-18 ℃冰箱中贮藏。每隔15 d随机取样品测定各项指标，实验周期为180 d。

1.3 指标测定

1.3.1 冻结曲线的测定 将自动温度记录仪探头插入沙光鱼中心部位，自动记录冻结过程中的温度变化，绘制沙光鱼的冻结曲线[5,17]。

1.3.2 蒸煮损失率的测定 称取10.0 g样品，85 ℃水浴锅中蒸煮15 min后取出，冷却至室温，用滤纸擦拭样品表面的水分，再次称量。按式(1)计算蒸煮损失率[18]。

式中，m1—蒸煮前样品的总质量，g；m2—蒸煮后样品的总质量，g。

1.3.3 TVB-N测定 TVB-N值采用GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》的方法测定。

1.3.4 TBA的测定 参照金枝等[19]的方法，取5.0 g鱼肉加入20 mL 5%的三氯乙酸混合，均质2 min，双层滤纸过滤，取5 mL上清液，加入5 mL 0.02 mol/L的TBA溶液混合均匀，沸水浴反应25 min，冷却至室温。在532 nm处测定吸光值，结果以mg/kg为单位。

1.3.5 K值的测定 称取4.0 g鱼肉，加入40 mL 10%高氯酸溶液，涡旋振荡1 min，8500 r/min离心15 min，重复操作一次，合并上清液，用氢氧化钠溶液调节pH至6.0～6.4，定容至50 mL，8500 r/min离心15 min，0.22 μm微孔滤膜过滤，4 ℃保存[5]。

HPLC条件：色谱柱C18，柱温为35 ℃；流速1.0 mL/min；流动相为0.02 mol/L磷酸二氢钾和0.02 mol/L磷酸氢二钾盐1∶1(V/V)的缓冲溶液(pH 6.0)；紫外检测器，检测波长254 nm；进样量为20 μL。

式中：K—次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤之和与三磷酸腺苷及其分解物总量之比的百分率，%；ATP—三磷酸腺苷含量，μmol/g；ADP—二磷酸腺苷含量，μmol/g；AMP—磷酸腺苷含量，μmol/g；IMP—腺苷酸含量，μmol/g；HxR—次黄嘌呤核苷含量，μmol/g；Hx—次黄嘌呤含量，μmol/g；

1.3.6 盐溶性蛋白含量的测定 参考王凤玉[20]、赵峰等[21]的方法，称取4.0 g鱼肉，加入10倍量的0.2 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl缓冲液，匀浆1 min，4 ℃条件8500 r/min离心10 min，弃去上清液，以洗去样品中的水溶性蛋白，重复操作3次。在沉淀中加入10倍量的0.5 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl缓冲液，浸提2 h，9000 r/min离心15 min，取上清液即为盐溶性蛋白溶液，用双缩脲法测定盐溶蛋白含量。

1.3.7 Ca2+-ATPase活性的测定 在试管中加入1 mL酶液，0.3 mL Tris-maleate缓冲液，0.1 mol/L CaCl2溶液、3.18 mL蒸馏水和0.3 mL 20 mmol/L ATP溶液，25 ℃水浴中反应5 min，加入1 mL 15% TCA终止反应。用双层滤纸过滤，在所得上清液采用钼酸铵法测定反应中释放出来的无机磷含量[20,22]。

式中：A、B分别为反应管和空白管生成的磷酸量(μmol)；t为反应时间(min)；盐溶蛋白质量为1 mL反应液所含的酶量(mg)。

1.3.8 感官评定 参考胡亚芹[9]的评定方法，选取10位经过专业培训的人员(男5女5，年龄20-30岁)组成感官评定小组，采用CSAS感官评定系统进行感官描述检测。将经过不同冻结方式处理的沙光鱼解冻清洗后，放在蒸笼上清蒸10 min。按照表1进行评分，考察色泽、气味、组织形态、肌肉弹性，采用加权平均法，色泽、气味、组织形态、肌肉弹性各占系数0.3、0.3、0.2、0.2，满分为10分，沙光鱼感官综合评分低于5分时，表示沙光鱼到达货架期，不再适合食用。

表1 沙光鱼感官评价表Table 1 Sensory evaluation of Synechogobius hasta

1.3.9 冰晶观察 将刀具提前预冷，取三种冻结方式处理的沙光鱼的背部肌肉，顺肌纤维方向切成5 mm×5 mm×3 mm大小，放入预冷的Carnoy固定液(体积比为6∶3∶1的无水乙醇、氯仿和冰醋酸)，-18 ℃固定24 h，新鲜的样品放入4 ℃固定24 h。固定之后经乙醇进行脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、苏木精-伊红染色，显微镜观察[23]。

1.4 数据处理

利用SPSS 26.0进行数据处理，采用Graph Pad Prism 8软件作图。

2 结果与分析

2.1 冻结曲线

沙光鱼的冻结曲线如图1所示分为三个阶段，第一阶段是冷却阶段，放出显热，降温速冻快，静止空气冻结、送风冻结和液氮速冻分别用了200、25、12 min。第二阶段是最大冰晶生成带区域0 ℃～-5 ℃，在此过程中大多数的水冻结成冰[24]，30 min之内通过为快速冻结，超过为慢速冻结[25]。静止空气冻结、送风冻结和液氮速冻通过0 ～-5 ℃的时间分别为：315、95和8.5 min，液氮速冻能快速通过最大冰晶生成带，对组织结构的破坏较小。第三阶段，主要是冻结一些残留的水分，显热和潜热同时放出，降温较快[8]。从图1中可以看出，静止空气冻结和送风冻结属于慢速冻结，液氮速冻为快速冻结。结果表明，液氮速冻大大缩短了冻结时间，对沙光鱼的品质影响更小。

图1 不同冻结方式下沙光鱼冻结曲线Fig.1 Freezing curve of Synechogobius hasta under different freezing methods

2.2 不同冻结方式对沙光鱼蒸煮损失率的影响

蒸煮损失率是评价肉制品持水力的指标之一。肉的持水性直接影响肉的多汁性、营养成分、嫩度和色泽等食用品质[26]。由图2可知，新鲜沙光鱼的蒸煮损失率为16.83%，有良好的持水能力。随着贮藏时间的增长，三种冻结方式的蒸煮损失率均呈现上升趋势。30 d内三组的蒸煮损失率无显著差异(P>0.05)。从60 d开始液氮组的蒸煮损失率显著低于其他两组(P<0.05)，180 d时液氮速冻、送风冻结、静止空气冻结的蒸煮损失率分别为29.35%、35.68%、42.35%，三组存在显著差异(P<0.05)。经静止空气冻结处理的沙光鱼的蒸煮损失率最大，可能因为冻结速度慢，形成了较大的不规则的冰晶，破坏了沙光鱼的组织结构，导致鱼肉持水力下降[16]。液氮速冻对沙光鱼的蒸煮损失率影响最小，说明经液氮速冻处理的沙光鱼具有良好的持水能力。Inês等[27]研究发现经液氮速冻的凡纳滨虾其蒸煮损失率明显降低，与本文结果一致。

图2 不同冻结方式对沙光鱼蒸煮损失率的变化Fig.2 The changes of cooking loss rate in Synechogobius hasta by different frozen methods

2.3 不同冻结方式对沙光鱼TVB-N的影响

挥发性盐基氮(TVB-N)是指具有挥发性的氨、二甲胺、三甲胺等与腐败相关的碱性含氮化合物[28]。TVB-N是用于评价鱼类新鲜程度的指标，其值越低说明越新鲜。根据GB 10136-2016规定：TVB-N值≤15 mg/100 g为一级鲜度，二级鲜度≤20 mg/100 g，合格品≤30 mg/100 g。由图3可知，新鲜沙光鱼TVB-N值为7.25 mg/100 g，在贮藏过程中，三种冻结方式处理的沙光鱼的TVB-N值均呈上升趋势，前期增长速度较缓慢，30 d内无显著差异(P>0.05)。后期增长速度较快[9]，静止空气冻结组在第105 d的TVB-N值为16.73 mg/100 g，属于二级鲜度，液氮速冻、送风冻结分别为10.83、14.65 mg/100 g处于一级鲜度。180 d时液氮速冻、送风冻结、静止空气冻结TVB-N值分别为13.15、18.84、24.02 mg/100 g，液氮组依然保持一级鲜度，送风冻结组为二级鲜度，静止空气冻结组为合格品。结果表明液氮速冻更好地抑制TVB-N值的增长，可能是因为液氮速冻的降温速度非常快，对细胞造成的破坏较小[29]，呈现良好的保鲜效果。

图3 不同冻结方式对沙光鱼TVB-N的变化Fig.3 The changes of TVB-N value in Synechogobius hasta by different frozen methods

2.4 不同冻结方式对沙光鱼TBA的影响

TBA值是评价肉制品脂肪氧化的重要指标，脂肪氧化程度越严重，TBA值会越大[29]。一般研究认为TBA 值超出2.0 mg/kg时，表明肉制品已变质，不能再食用[15]。如图4所示，随着冻藏时间的延长，三种冻结方式处理的沙光鱼TBA值均呈逐渐增长的趋势。冻藏初期TBA值增长缓慢，在30 d内三种冻结方式处理的样品TBA值无显著差异(P>0.05)。冻藏后期静止空气冻结组的TBA值上升速率最快，可能是冻结的速度慢，形成了较大的冰晶，对细胞的机械损伤较大，暴露在空气中的损伤面积大，导致脂肪氧化程度较高[13]。180 d时液氮速冻、送风冻结、静止空气冻结的TBA值分别为1.15、1.65、2.13 mg/kg，静止空气冻结组的TBA值已超出2.0 mg/kg，不宜食用，结果表明液氮速冻可以有效抑制沙光鱼的脂肪氧化。

图4 不同冻结方式对沙光鱼TBA的变化Fig.4 The changes of TBA value in Synechogobius hasta by different frozen methods

2.5 不同冻结方式对沙光鱼K值的影响

K值表示鱼的新鲜程度的指标之一，K值越小，说明越新鲜。K值20%以下为一级鲜度，20%～40%为二级鲜度，60%～80%为初期腐败鱼[14]。如图5所示，随着冻藏时间的增长，三种不同冻结方式的沙光鱼的K值均呈上升趋势。新鲜沙光鱼的K值为8.30%，冻藏初期三组无显著性差异(P>0.05)。60 d之后静止空气冻结的K值上升速度明显高于其他两组，到180 d时液氮速冻、送风冻结、静止空气冻结的K值分别为19.78%、25.08%、32.12%，三组存在显著性差异(P<0.05)。在整个冻藏期间液氮组的沙光鱼为一级鲜度，结果表明液氮速冻能有效维持沙光鱼的新鲜度，可以抑制ATP的降解。可能是因为液氮速冻的细胞较为完整，造成的机械损伤较小，抑制了微生物的生长，在ATP分解初期抑制反应，降低整体反应速率[30]。

图5 不同冻结方式对沙光鱼K值的变化Fig.5 The changes of K value in Synechogobius hasta by different frozen methods

2.6 不同冻结方式对沙光鱼盐溶性蛋白含量的影响

盐溶蛋白是评价鱼肉蛋白质冷冻变性的主要指标之一，其变性会对鱼肉加工特性产生很大的影响，其含量越低，表明蛋白质变性越严重。随着冻藏时间的延长，不同冻结方式的盐溶性蛋白含量均呈下降的趋势[29]。如图6所示，新鲜沙光鱼的含量为70.49 mg/g，在冻藏前60 d时静止空气冻结、送风冻结、液氮速冻的盐溶性蛋白含量分别为36.79、43.75、48.72 mg/g，比新鲜的盐溶性蛋白降低了47.81%、37.93%、30.89%，冻藏后期与前60 d相比下降速度较为平缓。180 d时液氮速冻、送风冻结、静止空气冻结的盐溶性蛋白含量为21.24、26.77、35.66 mg/g，三组盐溶性蛋白含量存在显著差异(P<0.05)。在整个贮藏过程中，静止空气冻结下降的速度最快，其次为送风冻结组，液氮组下降最慢。可能是由于蛋白质的部分结合水形成冰晶析出，导致肌动球蛋白分子之间相互形成非共价键进而形成超大分子的不溶性凝集，使肌动球蛋白溶解性下降[31]。结果表明，液氮组的盐溶性蛋白含量显著高于其他两组，说明液氮速冻能抑制蛋白质变性，这与崔珺[31]对带鱼的研究结果一致。

图6 不同冻结方式对沙光鱼盐溶性蛋白含量的变化Fig.6 The changes of salt soluble protein content in Synechogobius hasta by different frozen methods

2.7 不同冻结方式对沙光鱼Ca2+-ATPase酶活性的影响

Ca2+-ATPase酶活性用于反映肌球蛋白的完整性，活性大小可以判断鱼肉中肌球蛋白的变性程度[32]，其活性越高，说明沙光鱼的品质越好。如图7所示，随着冻藏时间的延长，三种冻结方式处理的沙光鱼的Ca2+-ATPase酶活性均呈下降趋势。新鲜沙光鱼的Ca2+-ATPase酶活性为0.355 μmol/min/mg，冻藏前期的下降速度较快，60 d时静止空气冻结、送风冻结、液氮速冻Ca2+-ATPase酶活性分别为0.177、0.215、0.267 μmol/min/mg，分别下降了50.14%、39.44%、24.79%；60 d后下降较为平缓，180 d时，三组的酶活性分别为0.055、0.099、0.187 μmol/min/mg，存在显著性差异(P<0.05)。整个贮藏过程中，静止空气冻结组的酶活力的下降速度最快，这可能是因为肌球蛋白的球状头部的构象发生变化以及蛋白质的凝聚造成了Ca2+-ATPase酶活性下降[15]。Xiong等[33]研究发现，草鱼肉蛋白-18 ℃冻藏30 d Ca2+-ATPase活性降低了71.4%。结果表明，液氮组的Ca2+-ATPase酶活性高于其他两组，可能是因为液氮的冻结速度快，冰晶细小且分布均匀，较好的保持了肌球蛋白的完整性。

图7 不同冻结方式对沙光鱼Ca2+-ATPase酶活性的变化Fig.7 The changes of Ca2+-ATPase enzyme activity in Synechogobius hasta by different frozen methods

2.8 不同冻结方式对沙光鱼感官评价的影响

感官评价能够直观反映食品品质，它是根据嗅觉、味觉、视觉、触觉等特性进行打分。通过打分的结果判断食品品质的优劣。新鲜沙光鱼组织完整，香味浓郁，肌肉富有弹性，初始的感官评分为10.0分。如图8所示，随着冻藏时间的延长，三种冻结方式处理的沙光鱼的感官评分均呈下降趋势。冻藏初期气味、色泽与新鲜样品差异不大，肌肉弹性较新鲜沙光鱼略差。液氮组、送风冻结组和静止空气冻结组的感官评分从开始的9.84、9.72、9.67分，下降到180 d的7.18、5.52、4.46分。液氮组冻藏期间感官评分降幅最小，品质保持地较好。静止空气冻结组下降的速度最快，180 d时鱼肉的品质已经严重下降，固有香味消失，肌肉松散，已经不可食用。是因为贮藏后期水产品的蛋白质变性、内源酶和微生物的作用，导致鱼肉变软，失去原有的香味，很大的降低了感官品质[34]。液氮组优于其他两组，可以有效延缓沙光鱼在冻藏过程中感官品质的下降。

图8 不同冻结方式对沙光鱼感官评价的变化Fig.8 The changes of sensory evaluation in Synechogobius hasta by different frozen methods

2.9 不同冻结方式对沙光鱼冰晶形成的影响

图9为不同冻结方式对沙光鱼冰晶形成的影响，从图中可以看出，新鲜沙光鱼的组织完整、排列致密整齐，无明显间隙。经三种冻结方式处理的沙光鱼在30 d时组织均出现间隙和不同程度的破碎变形。静止空气冻结组织的间隙最大，有明显的冰晶痕迹，表明静止空气冻结过程中形成较大且不规则的胞外冰晶，造成严重的机械损伤。送风冻结的组织间隙要比静止空气冻结的小，但形成了一些较大的冰晶也会对品质产生损害。液氮组形成的冰晶细小且均匀，组织结构较为完整与新鲜样品最接近，对组织细胞的机械损伤最小，能较好地维持沙光鱼的品质。结果表明，不同的冻结方式对沙光鱼肌肉组织有很大的影响，液氮速冻可以更好地保持沙光鱼的组织结构。

图9 不同冻结方式对沙光鱼冰晶形成的影响Fig.9 Effects of different freezing methods on the formation of ice crystals in Synechogobius hasta

3 结论

不同冻结方式对沙光鱼的各项理化指标均产生了显著的影响(P<0.05)。液氮组与其他两种冻结方式相比，大大缩短了冻结时间，细胞组织较为完整，形成的冰晶细小且分布均匀。随着冻藏时间的增加，TVB-N值、K值、TBA值和蒸煮损失率均呈上升趋势；Ca2+-ATPase活性、盐溶性蛋白含量和感官评分均呈下降趋势，在整个冻藏期间液氮组的各项指标变化的幅度始终低于静止空气冻结和送风冻结(P<0.05)。冻藏至180 d时，静止空气冻结处理的样品已不宜食用；液氮速冻处理的沙光鱼依然处于一级鲜度。说明液氮速冻能较好地保持沙光鱼的新鲜度，有效延缓脂肪氧化，并抑制蛋白质的冷冻变性。与其他两种冻结方式相比，液氮速冻保鲜效果最好，能提高沙光鱼冻藏期间的品质，延长货架期。