牡蛎酸羊奶的工艺优化及其品质分析

刘 荔，谢 伟，徐锦锦，赵元晖

(中国海洋大学食品科学与工程学院, 山东青岛266003)

牡蛎(Crassostrea gigas)素有“海中牛奶”之称，是一种重要的海洋经济贝类，具有调节机体免疫、抑制肿瘤、延缓衰老、降血糖、降血脂等生物活性[1]。近年来，我国牡蛎产量逐年增加，2019年牡蛎养殖产量达523万多吨[2]。牡蛎含有大量必需氨基酸和牛磺酸，是优质蛋白质的极佳来源。

目前，国内对于牡蛎的利用以传统加工方式为主，一般为鲜品、干制品、调味品及冻制品等形式，产品附加值较低。国外主要是以牡蛎中的部分功能活性成分为基料，开发胶囊、片剂及提取液等功能保健品[3-4]，对于牡蛎肉的利用度较低。目前，很少有研究能够将牡蛎肉全利用的同时高值化生产。牡蛎酶解液作为一种全牡蛎肉加工的产品，具有重要的经济价值。但是牡蛎酶解过程中产生的苦味和牡蛎本身的腥味难以去除，影响牡蛎酶解产品的接受度[5]。如何提高牡蛎肉的利用度，开发出无残渣、高值化的全牡蛎产品，是充分利用牡蛎肉加工的发展方向。

羊奶营养丰富、易吸收，被称为奶中之王，是世界上公认最接近人奶的乳品[6]。其蛋白质多为β-酪蛋白,可有效降低人体对乳蛋白质的过敏[7]。此外，羊奶富含不饱和脂肪酸，更易被人体消化吸收，且具有重要的生理功效，能够益智和促进视网膜的发育[8-9]。

本文研制了一种新型牡蛎酸羊奶，解决了牡蛎酶解液存在的腥苦味问题，实现了全牡蛎肉的加工利用。本产品不仅风味清香宜人、酸甜适口，同时还兼具了牡蛎和羊奶的双重营养和生物活性，能够满足现代消费者对酸奶新型口味和高营养价值的追求，为牡蛎的高值化利用提供了一种新的方式。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山羊奶 山东阳春羊奶乳业有限公司；新鲜牡蛎 山东省青岛市团岛农贸市场；中性蛋白酶(50000 U/g) 广西东恒华道酶制剂公司；德氏乳杆菌保加利亚亚种(1.2717Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus)、嗜热链球菌(1.2718Streptococcus thermophilus)、干酪乳杆菌(1.575Lactobacillus casei) 中国普通微生物菌种保藏中心；β-环糊精、阿拉伯胶、改性大豆卵磷脂 山东西王糖业有限公司；蔗糖 浙江仁和生物科技有限公司；MRS培养基、MRS肉汤培养基 青岛海博生物技术有限公司。

Brookfield CT3质构仪 美国Brookfield公司；AR2000流变仪 美国TA Instruments公司；MJBL12X11粉碎机 美的生活电器有限公司；C21-21k01电磁炉 广东美的生活电器制造有限公司；AR2130分析天平 上海佑科仪器仪表有限公司；Multifuge X1离心机 美国Thermo Scientific Heraeus公司；BKQ-B50II立式灭菌锅 山东博科消毒设备有限公司；PHSJ-3F实验室pH计 上海雷磁仪器有限公司；DNP-9012电热恒温培养箱 上海巴玖实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 全牡蛎营养粉的制备 取新鲜牡蛎于4 ℃冰水浸泡30 min，重复4次。将脱盐后的牡蛎按照料液比(v/v)为1∶2加水均质，使用蛋白酶(0.3%，50000 U/g)于50 ℃下酶解5 h，100 ℃沸水浴灭酶。冷却后加入包埋剂搅拌2 h，4 ℃条件下水化过夜(包埋剂为阿拉伯胶∶β-环糊精∶改性大豆卵磷脂∶抗氧化剂=17%∶13%∶1.8%∶0.06%，抗氧化剂的成分是茶多酚∶鼠尾草提取物∶生育酚∶没食子酸(w/w)=3∶1∶1∶1)。牡蛎包埋液过80目筛网，进行喷雾干燥，即得到全牡蛎营养粉。

1.2.2 酸奶制作工艺 酸羊奶：于200 mL羊奶添加4%～8%的蔗糖，并充分搅拌使其溶解。向混合液中接种4%～6%的乳酸菌种(保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌∶干酪乳杆菌(w/w)=2∶1∶1)，搅拌均匀并加盖密封。混合发酵液在40～44 ℃下发酵8～10 h，于4 ℃保藏12 h。牡蛎酸羊奶：于200 mL羊奶添加6%～10%的全牡蛎营养粉、4%～8%的蔗糖，并充分搅拌使其溶解。后续操作同酸羊奶的制作。

1.2.3 单因素实验 选用全牡蛎营养粉添加量(2%、4%、6%、8%、10%)、发酵剂添加量(3%、4%、5%、6%、7%)、蔗糖添加量(4%、6%、8%、10%、12%)、发酵温度(40、41、42、43、44 ℃)、发酵时间(6、7、8、9、10 h)为主要考察对象，以酸度值和感官评分为评价指标进行单因素实验，优化牡蛎酸羊奶制备工艺。初始发酵条件为全牡蛎营养粉添加量8%，发酵剂接种量4%，蔗糖添加量8%，发酵温度42 ℃，发酵时间8 h。

1.2.4 正交试验 基于单因素实验结果，选择4个主要影响因素：全牡蛎营养粉添加量、蔗糖添加量、发酵剂接种量和发酵温度。以感官评价作为考察指标，采用L9(34)设计进行 4因素3水平正交试验(表1)，以确定最优组合[10]。

表1 牡蛎酸羊奶发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Orthogonal experimental factors and levels of oyster goat yogurt fermentation conditions optimization

1.2.5 牡蛎酸羊奶的感官评价 由10名固定的食品专业的老师和同学对两种酸奶的外观色泽、气味、滋味、组织状态进行评定，满分为100分。酸奶样品的准备条件为4 ℃下储存24 h后取出，放置为室温，在感官测试前30 min在小盘中制备样品，每人盛放一茶匙[11]，具体的感官评价标准见表2。

1.2.6 牡蛎酸羊奶理化指标的测定 按照国标GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的方法测定蛋白质；脂肪含量的测定按照GB 5009.6-2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》检测；酸度采用滴定法测定，酸奶酸度(°T)为100 mL发酵乳消耗浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠的毫升数。

1.2.7 持水力的测定 称量空的50 mL离心管，记为M0，向每个离心管中加入35 g酸奶，称量其总重量为M1，在4 ℃条件下进行离心，4000 r/min，离心10 min。弃去上清液，称量此时的总质量记为M2，每组设置5个平行试验取平均值。持水力的计算公式为[12]：

1.2.8 表观黏度的测定 使用AR2000型流变仪进行测定，椎板20，60 mm，流变模式为测定温度25 ℃，剪切速率为0.1～100 s-1，样品点选定为90个。结果以剪切速率为60 s-1时黏度表示。

表2 牡蛎酸羊奶的感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria of oyster goat yogurt

1.2.9 牡蛎酸羊奶总固形物含量的测定 按照国标GB/T 12143-2008《饮料通用分析方法》中的方法进行 测定。

1.2.10 牡蛎酸羊奶氨基酸含量的测定 按照国标GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》中的方法进行测定。

1.2.11 牡蛎酸羊奶脂肪酸含量的测定 使用含有0.005%丁基化羟基甲苯(抗氧化剂)的氯仿/甲醇(2∶1)萃取脂质，通过使用14%三氟化硼-甲醇试剂进行酯化。通过气相色谱质谱(GC-MS)系统进行鉴定和定量，MS传输线和离子源温度设置为250 ℃，检测器温度为260 ℃，程序初始温度为150 ℃，保持3 min再以4 ℃/min从150 ℃设置为250 ℃，保持1 min，最后以10 ℃/min的速度升至260 ℃，最终保持时间为5 min。载气流速为1.0 mL/min的氦气。MS中的注入模式是电子撞击(EI)模式，电离能为70 eV。根据检测到的每种脂肪酸的相对MS峰面积(以内标为基准)计算结果[13]。

1.2.12 微生物指标的测定 大肠杆菌(Bacillus coli)的检测：按照国标GB 4789.18-2010《食品微生物学检验乳与乳制品检验》中的平板计数法进行测定；乳酸菌的检测：按照国标GB 4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》中的稀释平板法进行测定；致病菌由青岛分析测试中心检测完成。

1.2.13 质构的测定 采用BrookfieldCT3质构仪，选择CT3质构仪及4500力量感应元(CT34500115)，方形家具基台(TA-BT-KIT)。探头选用40 mm直径，170°浅角锥型探头(TA54)，测试前探头下降速度为10.0 mm/s，测试速度为1.0 mm/s，测试后探头回程速度为10.0 mm/s，返回高度为35 mm，触发力为5 g[14]。

1.3 统计分析

每个实验至少重复三次，取平均值。采用分析软件IBMSPSS Statistics25进行多元方差分析和显著性差异分析，以P<0.05表示差异显著。以平均值±标准差表示结果，结合主成分分析法分析并使用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 牡蛎酸羊奶发酵条件的单因素实验

2.1.1 全牡蛎营养粉添加量对牡蛎酸羊奶品质的影响 如图1所示，当牡蛎粉的含量达到8%时酸度为86 °T，感官评分最高，为91分。因此确定最优的牡蛎粉添加量为8%。

图1 全牡蛎营养粉添加量对牡蛎酸羊奶品质的影响Fig.1 Effects of the addition quantity of whole oyster nutritional powder on the quality of oyster goat yogurt

2.1.2 发酵剂添加量对牡蛎酸羊奶品质的影响 由图2可知，当发酵剂的接种量为4%时，酸度适中，为87 °T，感官评分最高为91分，由此确定发酵剂的最佳接种量为4%。

图2 发酵剂添加量对牡蛎酸羊奶品质的影响Fig.2 Effects of the addition quantity of start culture on the quality of oyster goat yogurt

2.1.3 蔗糖添加量对牡蛎酸羊奶品质的影响 适宜的添加蔗糖有利于改善酸奶的整体口感，避免酸度过低影响口感。如图3所示，当蔗糖添加量达到6%时，酸度为89 °T，感官评分达到最高为93分，因此确定蔗糖的最适添加量为6%。

图3 蔗糖添加量对牡蛎酸羊奶品质的影响Fig.3 Effects of sucrose addition on the quality of oyster goat yogurt

2.1.4 发酵温度对牡蛎酸羊奶品质的影响 发酵温度的适宜性与乳酸菌的生长繁殖密切相关，由图4可知，当发酵温度为42 ℃时，酸度为88 °T，感官评分分值最高为93分，因此选择发酵温度42 ℃作为牡蛎酸羊奶的最适发酵温度。

图4 发酵温度对牡蛎酸羊奶品质的影响Fig.4 Effects of fermentation temperature on the quality of oyster goat yogurt

2.1.5 发酵时间对牡蛎酸羊奶品质的影响 由图5可得，发酵时间为8 h的牡蛎酸羊奶酸度为88 °T，感官评分分值最高为92分，酸度适宜，因此选择发酵8 h作为牡蛎酸羊奶的最适发酵时间。

图5 发酵时间对牡蛎酸羊奶品质的影响Fig.5 Effects of fermentation time on the quality of oyster goat yogurt

2.2 正交试验优化牡蛎酸羊奶发酵条件

以感官评价作为考察指标，采用L9(34)设计的正交试验结果如表3和表4所示，由F值可得各因素对于牡蛎酸羊奶的感官评分的影响从高到低依次是A>C>B>D，即全牡蛎营养粉添加量>蔗糖添加量>发酵剂接种量>发酵温度。牡蛎酸羊奶的最优发酵工艺组合为A2B3C3D2，即全牡蛎营养粉的添加量为8%，发酵剂接种量为5%，蔗糖添加量为8%，发酵温度为42 ℃。最适组合未出现在试验组中，因此，对其进行验证试验。经验证得到的牡蛎酸羊奶酸度为87.1 °T，感官评分为93分，带有牡蛎清香，口感细腻，色泽均匀，整体呈淡黄色。

表3 牡蛎酸羊奶发酵条件正交试验结果与分析Table 3 Orthogonal experimental results and analysis of oyster goat yogurt fermentation conditions

表4 正交试验方差分析结果Table 4 Orthogonal experimental variance analysis results

如图6所示，酸羊奶感官评分明显低于牡蛎酸羊奶，这可能因为羊奶中富含中短链脂肪酸，产生膻味降低产品接受度[15]。牡蛎酸羊奶中由于全牡蛎营养粉的加入，同时包埋的壁材β-环糊精对羊奶有很好的除膻效果，整体气味柔和怡人，黏稠度较好，感官分值明显升高[16]。

图6 牡蛎酸羊奶感官评分图Fig.6 Oyster goat yogurt sensory score chart

2.3 牡蛎酸羊奶的理化指标检测

在优化后的工艺条件下制备牡蛎酸羊奶，蛋白质、脂肪和酸度含量如表5所示，理化指标均符合国家标准GB 19302-2010 《食品安全国家标准发酵乳》。牡蛎酸羊奶的持水力和总固形物含量显著高于酸羊奶(P<0.05)，两种酸奶的蛋白质、脂肪含量和酸度、粘度无显著性差异(P>0.05)。添加全牡蛎营养粉的酸奶蛋白质、脂肪含量增加，具有更高的营养价值，且黏度高、持水力强，口感更为丰富。

表5 牡蛎酸羊奶的理化指标结果Table 5 Physical and chemical index results of oyster goat yogurt

2.4 牡蛎酸羊奶的氨基酸检测结果

如表6所示，添加全牡蛎营养粉发酵得到的牡蛎酸羊奶中，氨基酸总含量为3.36 g/100 g，与普通酸羊奶相比，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸的含量显著增加(P<0.05)，这与牡蛎的氨基酸结果相一致[17-18]。必需氨基酸评分如表7所示，与普通酸羊奶相比，牡蛎酸羊奶氨基酸模式更接近人体蛋白质的氨基酸模式，即牡蛎酸羊奶更易被人体吸收利用。羊奶中自身含有丰富的蛋白质以及多种必需氨基酸[19]，但与标准模式相比所占比例较低；牡蛎酸羊奶中的苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸的模式比例均接近WHO/FAO标准模式，说明牡蛎酸羊奶的氨基酸丰富，且配比更加合理，具有较高的营养价值。

表6 牡蛎酸羊奶氨基酸检测结果Table 6 Amino acid test results of oyster goat yogurt

表7 牡蛎酸羊奶中的必需氨基酸评分表Table 7 Scoring table of essential amino acids in oyster goat yogurt

2.5 牡蛎酸羊奶脂肪酸检测

脂肪酸是评价食品营养的重要指标，据英国卫生部建议，人类饮食中的PUFA/SFA应高于0.45，并且n-6/n-3 PUFA的比例应不超过4.0[20]。如表8所示，牡蛎酸羊奶中含有17种脂肪酸，其中饱和脂肪酸(SFA)8种，单不饱和脂肪酸(MUFA)5种，多不饱和脂肪酸(PUFA)4种。单不饱和脂肪酸主要是C18:1(油酸)和C16:1，多不饱和脂肪酸主要是C18:2(亚油酸)和C18:3 n-3(亚麻酸)，饱和脂肪酸主要为C16:0，C18:0和C14:0。酸羊奶中的饱和脂肪酸以C14:0、C16:0、C18:0为主，奇数碳链的脂肪酸含量低，总体而言脂肪酸分布较为均衡[21]；与酸羊奶相比，牡蛎酸羊奶的SFA下降，MUFA中的C14:1、C16:1、C17:1、C18:1和PUFA中 的C18:2 n-6和C20:5 n-3显著增加(P<0.05)。原因可能是牡蛎的添加和共同发酵增加了酸奶产品中不饱和脂肪酸的比例，从而降低了饱和脂肪酸的相对含量。此外，牡蛎酸羊奶的PUFA/SFA值为1.73，大于0.45，n-6/n-3 PUFA低于4.0，符合人类膳食标准。

表8 牡蛎酸羊奶脂肪酸检测结果Table 8 Oyster goat yogurt fatty acid test results

2.6 牡蛎酸羊奶的乳酸菌活菌数

乳酸菌的数量能直接表示乳酸的发酵程度和营养价值[22]。国标规定：为保证乳酸菌在人体肠道中的存活率以发挥其保健性，每毫升酸奶产品中乳酸菌活菌数不得低于1×106CFU/mL[23]。如表9所示，优化后研制的牡蛎酸羊奶的活菌数为9.27 lg CFU/mL，普通酸羊奶的乳酸菌活菌数为8.42 lg CFU/mL。霉菌数、酵母数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌，符合GB 19302-2010要求，说明将牡蛎与羊奶两种原料共同发酵更有利于促进乳酸菌活菌数的增加。这是由于在混合菌种的发酵条件下，菌株之间的共生性促进总体活菌数的增加，而全牡蛎营养粉的加入进一步为乳酸菌的生长和传代提供了丰富的营养物质。

表9 牡蛎酸羊奶乳酸菌活菌数测定结果Table 9 Results of determination of the number of viable lactic acid bacteria in oyster goat yogurt

2.7 牡蛎酸羊奶的质构特性及对比分析

酸奶的质构特性不仅会影响酸奶的整体口感，而且与酸奶的持水力以及储藏期间的乳清析出率密切相关，一般稠度较高、黏度较大的酸奶，其持水力也较强[24]。结果如表10所示，与酸羊奶相比，牡蛎酸羊奶的粘合力、粘附性、稠度和硬度显著增加(P<0.05)，在弹性上无显著性差异(P>0.05)。原因可能是在发酵过程当中牡蛎被乳酸菌发酵利用，形成更为复杂而稳定的胶体结构，提高了整体的凝胶能力[25]。这表明添加全牡蛎营养粉后，提高了乳酸菌的发酵能力和对营养物质的利用程度，制成的牡蛎酸羊奶质地均匀、口感丰富，与感官评价的结果一致。

表10 牡蛎酸羊奶的质构结果Table 10 Texture result of oyster goat yogurt

采用主成分分析法(PCA)对酸羊奶和牡蛎酸羊奶的基本营养成分、质构特性、感官评分进行综合分析。如图7所示，PC1的贡献率为76.9%，PC2的贡献率为10.2%，两种主成分共计87.1%(>85%)。所有指标相互关联，均呈正相关关系，说明牡蛎酸羊奶的蛋白质、脂肪含量与质构特性以及最终的感官评分密切相关。牡蛎酸羊奶和普通酸羊奶的PC值沿第一主成分增大的方向分布较远，即牡蛎酸羊奶在营养价值和质构性质上可与酸羊奶有效区分。综合表10可以得到，加入全牡蛎营养粉的酸奶与未添加的相比营养价值提高，硬度、粘弹性增加，丰富了酸奶的营养和口感[26]。

图7 牡蛎酸羊奶的营养及质构主成分分析图Fig.7 The principal component analysis of texture of oyster goat yogurt

3 结论

本研究以牡蛎和纯羊奶为主要原料，探讨了制备牡蛎酸羊奶的最优工艺条件，并对其营养价值和品质进行分析。研究表明，牡蛎酸羊奶的最优发酵工艺为全牡蛎营养粉的添加量为8%，发酵剂接种量为5%，蔗糖添加量为8%，发酵温度为42 ℃。此时得到的牡蛎酸羊奶酸度为87.1 °T，感官评分为93分，理化指标以及微生物指标均符合国家相关标准，氨基酸和不饱和脂肪酸含量丰富，质构方面黏度、弹性和硬度更加均衡。牡蛎酸羊奶营养价值高且品质均匀稳定，但其具体风味及滋味特性仍需要进一步的研究。本研究不仅丰富了酸奶市场，而且为牡蛎实现高值化利用，促进牡蛎新型产品的开发提供了理论依据。