重组人汗腺抗菌素蛋白的异源可溶表达、发酵优化及分离纯化研究

马文君，郭校燕，滕 琳，王培培，卫宏远，郑春阳

(1.天津大学，天津 300350；2.天津强微特生物科技有限公司，天津 300384；3.舒泰神（北京）生物制药股份有限公司，北京 101100；4.守正创新生物科技（天津）有限公司，天津 300384)

一些食品添加剂如亚硝酸盐和二氧化硫等化学防腐剂的过量使用可能会对人体健康和食品营养水平造成不良影响[1]。由于过度使用化学防腐剂，细菌产生了耐药性，因此迫切需要寻找新的天然防腐剂来保存食品[2]。抗菌肽是广泛存在于动植物、昆虫和细菌中的一类天然细胞多肽[3]。使用抗菌肽作为生物防腐剂对食品进行保鲜，可以同时提高食品的货架期和对人体的安全性[4-5]。它可以保护宿主免受病原微生物的侵害。抗菌肽的发现有望成为化学防腐剂的替代品，其中乳链菌肽(Nisin)是目前食品保鲜中应用最广泛的抗菌肽[6]。

人汗腺抗菌素DCD-1L是一种来源于人体皮肤的抗菌肽，稳定性好，在汗液中至少能抵抗蛋白水解长达40 h。DCD-1L是德国科学家Shcittek等[7]2001年从人体汗液中分离得到的小分子阴离子抗菌肽，具有广泛应用前景。比如，DCD-1L有很好的抗菌活性，它能够抑制多种病原微生物，对抗包括金黄色葡萄球菌、粪大肠杆菌、大肠埃希菌、恶臭假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等在内的细菌表现出较强的抗菌活性[8-9]。目前，获得DCD-1L的方式包括：从人汗液中直接分离、化学合成和基因重组表达等[10]。DCD-1L在人体汗腺中浓度为1～10 μg/mL，从人汗液分离DCD-1L是一个非常烦琐的过程，而且分离的量有限[11]，而化学合成DCD-1L成本太高。通过基因重组表达技术分离纯化抗菌肽是目前广泛采用的方法，大肠杆菌表达系统可以有效改善真核表达系统如哺乳动物细胞和转基因小鼠成本高、周期长，产业化困难的现状[12-13]。DCD全长110个氨基酸残基，成熟的DCD-1L是位置在63～110的48个氨基酸，分子量4.8 kDa[14]。许多学者分别利用毕赤酵母表达和大肠杆菌系统进行DCD-1L的诱导表达，其中毕赤酵母表达量过低无法进行后续研究[15-16]。赖玉平[16]利用大肠杆菌表达系统，以融合蛋白形式进行诱导表达DCD-1L，但是表达后还需要蛋白酶酶切释放DCD-1L。目前的报道主要集中在重组质粒的构建[17-19]，关于后期纯化的报道相对较少：如Cipáková在大肠杆菌中以包涵体的形式表达一种含有C-末端高丝氨酸内酯的DCD-1L-1Hsl，再利用溴化氰CNBr水解法裂解融合蛋白蛋氨酸的C末端，但其裂解效率较低，并不适合大规模生产[20]。在另一项研究中，利用IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)系统在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DCD-1L，再通过几丁质亲和层析纯化[21]。IMPACT系统完全避免了蛋白酶的使用，可以有效降低成本。但是，intein需要在较低的温度和还原条件下才发生自身介导的N端裂解，从而释放出与之相连的目的蛋白，然而还原剂的存在会破坏/影响蛋白的二级结构[22]。Ushanandin等[9]利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组DCD-1L，后续还要利用Ulp1蛋白酶切除SUMO标签，而Ulp1蛋白酶对酶解温度和pH有较高的要求[23]，对DCD-1L的后续纯化提出更高的要求。

本文在先前研究的基础上，拟通过基因工程技术，将优化的DCD-1L基因片段克隆到pET28a + 载体上，以His组氨酸为标签，转化大肠杆菌表达菌株，将确定可诱导表达DCD-1L的菌株，经过大规模发酵、分离和纯化，获得高纯度的DCD-1L，并初步对其抗菌活性进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌Escherichia coliDH5α、Escherichia coliBL21 (DE3)、Escherichia coliER2566、质粒pET28a+ 均由本实验室保存；限制性内切酶 New England Biolabs公司；胶回收试剂盒 Promega公司；质粒小提试剂盒 天根生化科技有限公司；SDSPAGE电泳凝胶试剂盒、高保真PCR聚合酶 天津强微特生物科技有限公司；实验所用纯化填料 均来自美国GE healthcare；其他试剂 为国产分析纯。

超滤管超滤离心管 美国Millipore公司；AKTApurifier TM100纯化系统 美国GE healthcare；SCIE10TI-IID超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技有限公司；垂直电泳仪 美国 Bio-Rad公司；凝胶成像系统 美国UVP公司；液体发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司；GL-21M高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；单四极杆质谱仪(LC-MSD) 美国安捷伦公司；UV3100紫外可见光分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 人源DCD-1L的基因克隆及载体构建 根据NCBI上人源DCD -1L基因编码的碱基序列信息(Gene ID：117159)，确定目的基因序列如下：5，-CATATGAGTAGTCTGCTGGAAAAAGGCCTGG ATGGCGCAAAAAAGGCAGTTGGCGGCCTGGG CAAACTGGGTAAAGATGCCGTTGAAGATCTG GAAAGTGTGGGTAAAGGCGCCGTGCATGATG TGAAAGATGTGCTGGATAGCGTTCTGTAACAT ATG-3，其氨基酸组成序列为：SSLLEKGLDGA KKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHD VKDVLDSVL，确定本实验的目的克隆序列。

经密码子优化后合成目的基因片段由通用生物公司合成，通过无缝连接技术将目的片段插入到pET28a+上，得到质粒pET28a-DCD-1L。将构建好的质粒用限制性内切酶NdeI酶切验证，配制50 μL反应体系(5 μL的NEBuffer，1 μL NdeI酶)，在37 ℃条件下反应1 h，将所得酶切产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳。将经过验证的质粒分别转化E. coliBL21(DE3)和E. coliER2566感受态细胞，用Kan抗性平板进行转化子筛选，将筛选得到的正确克隆菌株，加入甘油，进行-80℃保藏，用于后续研究。

1.2.2 DCD-1L的诱导表达及条件优化 将-80 ℃保藏的重组表达菌株BL21 (DE3)-pET28a-DCD-1L和ER2566-pET28a-DCD-1L复苏后，接种于5 mL含50 μg/mL卡那霉素(Kan)的LB培养基中，37 ℃，100 r/min振荡过夜活化。将活化的BL21(DE3)-pET28a-DCD-1L和ER2566-pET28a-DCD-1L继 续扩大培养接种于100 mL含有Kan的LB液体培养基中。当菌液A600达0.5～0.7时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1～1 mmol/L进行诱导表达。经条件优化后，确定诱导剂IPTG的添加量为0.5 mmol/L，16 ℃诱导过夜，菌体经6000 × g，10 min离心收集，利用超声破碎仪破碎大肠杆菌细胞(超声功率180 W，超声2 s，暂停2 s，总超声时间为5 min)，离心得到菌液上清和沉淀，再用50 mmol/L Tris-HCl将沉淀复溶，进行SDS-PAGE分析，配制12%分离胶和5%浓缩胶，恒定功率10 W，当条带迁移距底端1～2 cm处停止电泳[24]。

由于DCD-1L分子量较小，常规的考马斯亮蓝染色无法观察到目的条带，因此电泳结束后选用更加灵敏的硝酸银染色，操作顺序如下：采用30%乙醇，10%乙酸固定至少30 min，用20%乙醇漂洗2次，0.8 mmol/L硫代硫酸钠中浸泡1 min敏感化、双蒸水漂洗2次、用12 mmol/L硝酸银溶液浸渍银染持续20～120 min，准备水和显影溶液，按照银染-水-显影液的顺序将凝胶从银染液中取出，放入水中漂洗10 s，再从水中取出放入显影液中，轻轻晃动，继续显色至条带清晰，取出放入终止液中至少30 min终止反应，用双蒸水漂洗两遍，每次30 min[25]。

1.2.3 重组表达菌株ER2566-pET28a-DCD-1L发酵条件的研究 取保存于-80 ℃冰箱的菌种，按照1%添加量接于含Kan抗性的600 mL LB培养基中作为种子液，37 ℃，200 r/min，摇床培养过夜。次日，按照8%的接种量将种子培养基接入发酵罐中，设定温度和转速同种子液培养，用氨水调节pH，当A600=7.8时，加入7 mL 0.5 mmol/L的IPTG进行诱导，诱导3 h后进行SDS-PAGE。

1.2.3.1 发酵温度对目标蛋白DCD-1L表达量的影响 利用发酵罐对重组表达菌株ER2566-pET28a-DCD-1L进行发酵，由于体系变大，获得目的蛋白的最佳温度不一定同摇瓶发酵条件一致，因此在10 L发酵罐中，分别控制温度为27、32、37及42 ℃进行发酵，研究温度对目标蛋白DCD-1L表达量的影响。每隔6 h取样跑胶进行SDS-PAGE，用Image J软件分析电泳条带灰度，计算目的蛋白条带所占百分比从而确定目标蛋白DCD-1L表达情况。

1.2.3.2 搅拌转速对目标蛋白DCD-1L表达量的影响 采用优化发酵温度，分别控制搅拌转速为250、300、350和400 r/min进行搅拌，研究搅拌转速对目标蛋白DCD-1L表达量的影响。

1.2.3.3 补料速度对目标蛋白DCD-1L表达量的影响 采用优化发酵温度及搅拌转速，当A600=1.0时开始补充高浓度0.125 g/mL胰蛋白胨、0.125 g/mL酵母粉和0.25 g/mL葡萄糖，两种溶液分别高温灭菌后，接种前混合均匀后连接到发酵罐，开启蠕动泵分别以30、50、70和90 mL/30 min补料速度自动加入发酵罐中，确定补料速度对目标蛋白DCD-1L表达量的影响。

1.2.4 重组DCD-1L的纯化 将发酵液离心后收集菌体(14000 r/min，25 min，4 ℃)，用50 mmol/L Tris-HCl, pH8.0，1 mmol/L EDTA，0.1 mol/L NaCl，0.1 mmol/L PMSF，按照质量比1∶20重悬分散菌体，高压均质破菌均质3次压力分别为(300、850和950 bar)离心后收集上清液(14000 r/min，25 min，4 ℃)，过0.45 μm滤膜，获得上清液，用于纯化。

1.2.4.1 细胞破碎上清液超滤 取300 mL上述过滤后的上清液，利用Millipore Amicon® Ultra-15 10 K离心过滤器，离心条件为4000 r/min，20 min，4 ℃，取滤出部分。

1.2.4.2 细胞破碎上清液Q柱洗脱 分别配制缓冲溶液Q-A：pH9.0，20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，缓冲溶液Q-B：pH9.0，20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl。取150 mL破菌上清10 kDa超滤滤出液，以HiTrapQ HP预装柱进行层析纯化。以流速2.5 mL/min，0～50% Buffer B(20 mmol/L Tris-HCl，pH9.0，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl)进行洗脱，收集各步骤样品，进行SDS-PAGE电泳检测。

1.2.4.3 细胞破碎上清液分子筛 配制pH6.5，10 mmol/L PB，0.1 mol/L NaCl，将Q柱洗脱目的组分经过HiPrep 26/60 Scphacryl S100柱层析，收集各步骤样品，进行SDS-PAGE电泳检测并分析蛋白纯度和计算回收率。以上各步纯化所得蛋白样品均进行SDS-PAGE检测，对检测结果分别用Image J软件进行条带灰度分析，计算出目的蛋白条带所占每步总蛋白条带的百分比，即为目的蛋白的纯度。回收率的计算是利用Bradford法计算出高压均质后的蛋白总浓度，乘以目的蛋白的纯度即为初始目的蛋白总浓度CTotal，超滤、Q柱、S100柱纯化后的目的蛋白浓度测定方法相同，并分别以CU、CQ和CS表示，相应得到的样品体积为VU、VQ、VS，则各步骤纯化后的回收率为：

1.2.5 重组DCD-1L蛋白质谱分析鉴定 将上述洗脱后收集的目的峰进行单四极质谱仪(液相色谱配套6120B)分析，试验参数为：0 min 70%的水和30%的乙腈，以流量为0.3 mL/min梯度洗脱10 min后，变为30%的水、70%的乙腈，质谱扫描范围是115～500，进样量5 μL使用MSD控制，常规调谱文件atunes.tun离子源为API-ES，缝宽0.100 min，循环时间1.69 s/cycle。

1.2.6 DCD -1L抗菌活性检测 本试验选取阴性对照(pET28a+空载质粒破菌后上清)、阳性对照(1 mg/mL氨苄霉素)、pET28a-DCD-1L破菌的上清液和纯化得到的DCD-1L蛋白，分别考察其对表皮葡萄球菌ATCC12228(革兰氏阳性菌)和大肠杆菌DH 5α(革兰氏阴性菌)生长的影响。将表皮葡萄球菌ATCC12228，大肠杆菌DH 5α进行复苏，细菌在营养肉汤培养基中生长至对数中期，将两种指示菌分别涂布营养肉汤(NB)固体培养基，分别在平皿上放置牛津杯，用移液枪吸取等量的样液滴至牛津杯中，将平板置于37 ℃过夜培养，观察结果。

1.3 数据处理

实验中每个处理重复3次，采用SPSS 22.0软件进行数据显著性分析，应用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 人源DCD-1L基因的克隆与载体构建和表达

如图1所示，构建好的质粒经NdeI单酶切后，由1%琼脂糖凝胶结果可知，目标条带大小为5000～7500 bp，复合预期大小5369 bp，将构建好质粒分别转化至不同感受态细胞，诱导后检测目标蛋白DCD-1L表达情况。

图1 质粒pET28a-DCD-1L经NdeI单酶切鉴定图Fig.1 Identification of the cloning expression vector by NdeI enzyme digestion

如图2所示，将构建好的pET28a-DCD-1L质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，接种培养后，经过IPTG诱导后，目标蛋白DCD-1L并没有实现表达，诱导前后在低于14.4 kDa没有条带变化。而转化至ER2566感受态细胞可实现目标蛋白的可溶表达(见图中红色虚框)。感受态细胞BL21(DE3)和ER2566均来源于BL21，可用于T7启动子表达载体(如pET系列)的高水平蛋白表达[26]，但二者主要区别在于ER2566为Lon和ompT蛋白酶缺陷菌株。Lon蛋白酶和膜外蛋白酶ompT的缺失能够有效抑制异源蛋白在大肠杆菌体内的降解，提高外源DNA的转化效率[27]。

图2 SDS -PAGE检测不同大肠杆菌菌株对DCD-1L的诱导表达Fig.2 SDS-PAGE analysis expression of recombinant DCD-1L in different competent cell

2.2 重组菌ER2566-pET28a-DCD-1L发酵条件优化

大肠杆菌在不同的发酵条件下，如温度、转速和补料速度等培养条件下，目标蛋白的产量也会有很大的差异。因此，为进一步研究重组大肠杆菌ER2566-pET28a-DCD-1L的发酵特性，以提高DCD-1L的产量，缩短发酵周期，同时降低发酵成本，对重组菌株ER2566-pET28a-DCD-1L的培养条件进行优化。

由图3A可知，随着发酵温度的提高细胞干重和DCD-1L含量逐渐增加，并在37 ℃达到最高值，42 ℃时细胞干重和DCD-1L含量下降。温度是发酵生产的重要参数直接影响细胞内各种酶活性[28]。发酵温度升高酶反应速率提高，可有效缩短发酵周期。超过最适温度会导致大肠杆菌细胞内酶失活，菌体容易衰老，影响目的蛋白DCD-1L最终产量。

图3 重组菌ER2566-pET28a-DCD-1L发酵条件的研究Fig.3 Study on fermentation conditions of recombinant strain ER2566-pEt28a-DCD-1L

由图3B可知，搅拌转速对细胞干重和DCD-1L产量具有明显影响，随着转速提高细胞干重和DCD-1L含量逐渐增加。转速影响培养基中的溶氧量，发酵过程中营养物质的充分混匀提高菌体对营养物质的利用率；另一方面过高的转速产生的剪切力会对菌体产生影响[29]。本实验选用较低的转速(不大于400 r/min)，由结果可知搅拌速度在400 r/min并没有抑制细胞生长。

由图3C可知，随着补料速度提高，细胞干重和DCD-1L产量先增加后降低，过高的补料速度并不利于菌体生长，主要原因是快速增长的菌体会消耗大量氧气，使得发酵罐体溶氧量迅速下降反而不利于菌体生长[30]。

通过单因素实验，对不同温度、不同转速、不同补料速度等发酵条件进行了研究与优化，确定重组大肠杆菌ER2566-pET28a-DCD-1L发酵生产DCD-1L的最适条件为：接种量为8%，37 ℃，400 r/min，开启蠕动泵以50 mL/30 min补料速度自动加入发酵罐中，进行培养发酵。

2.3 重组DCD-1L的分离纯化

2.3.1 细胞破碎上清液超滤 发酵液离心后收集菌体，菌体经过超高压均质破碎后离心收集上清液，将上清液移入10 kDa超滤管，在4000×g、4 ℃条件下离心超滤20 min，收集流穿，将离心超滤前后的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图4所示：空色虚框内为目的蛋白，超滤已去除大量杂质蛋白，但还有部分残留。根据DCD-1L蛋白氨基酸组成，在expasy网站上预测其蛋白等电点为5.07(https://web.expasy.org/protparam/#opennewwindow)，随后利用强碱性阴离子交换树脂(Q柱)进行柱层析。

图4 超滤前后重组蛋白DCD-1L对比情况Fig.4 Comparison of recombinant protein DCD-1L before and after ultrafiltration

2.3.2 超滤后上清液Q柱洗脱 将上述超滤后得到的样品Q柱上样，梯度洗脱10 min后，用50%～100% Buffer B(20 mmol/L Tris-HCl，pH9.0，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl)继续洗脱2 min，结果如图5所示，在洗脱体积为200～230 mL(约0.4 mol/L NaCl)洗出2个峰，230～250 mL(约0.7 mol/L NaCl)洗出1个峰，后对洗脱结果进行SDS-PAGE，确定先洗脱出来的两个峰为杂峰，最后洗脱出来的为目的峰(红色虚框标出的为目的蛋白)，由电泳图可知还有部分杂质蛋白的存在，根据分子量大小区别，后续利用分子筛进行层析分离。

图5 重组蛋白DCD-1L Q柱离子交换层析纯化曲线Fig.5 Q anion exchange chromatography purification curves of recombinant DCD-1L

2.3.3 Q柱洗脱后分子筛层析 收集Q柱洗脱下来的目的峰，上样S100分子筛，经过10 mmol/L PB溶液，pH6.5，0.1 mol/L NaCl洗脱，如图6所示获得一个非对称峰，就该峰不同部位分别收集跑SDSPAGE确定，峰尾部分为单一目的条带。

经高压均质获得的细胞上清液，依次经过超滤、Q柱、分子筛，最终获得一条低于14.4 kDa之间的条带(如图6)，而预期重组蛋白大小为4.8 kDa，在14.4 kDa Marker下方。重组人DCD-1L蛋白纯化工艺各步骤回收率如表1所示，纯化回收得到的产品纯度96%以上，总回收率为18.4%。为确定其准确分子量大小，后续进行质谱检测。

图6 重组蛋白DCD-1L 分子筛S100纯化曲线Fig.6 S100 purification curves of recombinant DCD-1L

表1 重组人DCD-1L蛋白纯化工艺各步骤回收率Table 1 Recovery rate of each step of the purification process of recombinant human DCD-1L

2.4 DCD-1L蛋白质谱分析鉴定

如图7所示，收集从分子筛S100洗脱下来的峰尾1和峰尾2，富集后用单四极杆液质联用系统，通过分子量信息快速鉴定化合物。由液相色谱图可知，在2.792 min有一个极强吸收峰，后利用质谱数据分子离子峰的相对强度，对于C，H，N，O组成的化合物，其通式为：CXHYNZOW，RI(M+1)/RI(M)*100=1.1x+0.37z和RI(M+2)/RI(M)*100=(1.1x)2/200+0.2w[31]，目标化合物检测预期最大分子量为4862 Da，与目的蛋白4.8 kDa，大小一致，表明该蛋白为重组DCD-1L蛋白。

图7 重组蛋白DCD-1L LC-MS图Fig.7 LC-MS map of recombinant DCD-1L

2.5 DCD-1L活性定性检测

DCD-1L是从人体汗液中分离出来的一种天然活性多肽，在较广的pH范围和高盐浓度下都具有抗部分细菌和真菌的活性[32]。由图8可知，DCD-1L对大肠杆菌和表皮葡萄球菌均有抑菌作用，对表皮葡萄球菌抑菌活性更高。

图8 DCD-1L对表皮葡萄球菌(a)和大肠杆菌(b)的抗菌活性Fig.8 activities of DCD-1L anti Staphylococcus epidermidis and Escherichia coli

3 结论

尽管在2001年研究人员就已经发现DCD-1L的抗菌特性，但在文献中只有很少的构建纯化系统被报道。为数不多的生产和纯化DCD-1L的方法均是基于融合蛋白的方式。本研究所构建的重组菌可实现人源DCD-1L的异源可溶表达，通过建立稳定的纯化工艺，直接得到无需酶切的DCD-1L，最终得到的重组DCD-1L纯度大于96%，可用于后期大量生产。本研究目前的一个局限性是缺乏对其他细菌和真菌抑菌活性的数据。因此，DCD-1L对链球菌、痤疮丙酸杆菌等病原菌的抑菌活性有待进一步研究。接下来将进一步研究对不同细菌的抗菌活性、最小抑菌浓度以及及抑菌机理。本实验建立的DCD-1L异源表达体系更为简便，为其进一步的理论和工业应用研究奠定了基础。