5406放线菌对西瓜的促生作用及对西瓜枯萎病的防控

孙于淼， 吴慧玲， 张涛涛， 董 丹， 白庆荣

(1.吉林农业大学植物保护学院， 长春 130118； 2.北京市农林科学院植物保护环境保护研究所， 北京 100097)

西瓜是驱热解暑的常备水果，在夏日很受人们的喜爱。因此，西瓜的产量和品质问题越来越受到重视，目前西瓜生产上主要存在的病害有：枯萎病、蔓枯病、细菌性果斑病等[1]，使西瓜产量和品质下降，严重危害了瓜农的收益。

西瓜枯萎病由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)侵染引起，俗称“死秧病”，各生长期均可侵染，是一种常见的土传和种传病害，典型症状是萎蔫[2]。主要防治方法包括嫁接，选育抗病品种，施用化学药剂，生防菌剂等[3]。农业上常通过喷雾、灌施等方法施用化学农药来防治西瓜枯萎病，虽见效快、适用性广，但易形成农药残留，并使病原菌产生抗药性[4]，同时，也会杀灭土壤中的有益菌。因此，亟须生产高效低危害的生防菌剂，目前应用最广泛的有细菌和放线菌，真菌的木霉属[5]和非致病性镰刀菌[6]皆可用来防治枯萎病。

放线菌中的链霉菌能产生多种植物激素促进植物生长[7-8]，还能通过提高植物净光合率、蒸腾速率、气孔导度等来提高植物光合生理[9-10]。菌株Streptomyces.ahygroscopicusn. var. gongzhulingensis具有广谱抑菌活性，对水稻稻瘟病病原菌等16种植物病原菌均有抑制效果[11]。

细黄链霉菌5406(Streptomycesmicroflavus)又称泾阳链霉菌，尹莘耘[12]首次研发出5406抗生菌肥，并通过试验证明其对黄瓜、辣椒、西红柿等作物均具有增产效果[13]，1986年发现5406可产生玉米素、激动素等有效活性物质，并具有解磷、固氮等作用[14]，且广泛应用于蔬菜、水果等植株的栽培上[15]。随后的研究中也发现5406放线菌不仅对小麦幼苗有明显的促生作用，也可促进辣椒，油菜，茄子的生长[16-19]。在对其抑菌效果研究中发现泾阳链霉菌对枯草芽孢杆菌、白菜黑斑病等植物病原菌均有明显的抑制作用[20]。

在实际大田生产中，单一菌剂往往不够稳定，达不到预期效果，因此采用菌剂复配，期望得到更好的防病效果。粉红螺旋聚孢霉(Clonostachysrosea)是一种重要的生防菌，能促进植物的生长，并抑制病原菌生长，张洁等[21]发现粉红螺旋聚孢霉NF-06可有效降低土壤中根结线虫数量，随后发现其还可抑制林果枝干中的葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和黑腐皮壳菌(Valsamali)[22]，田甜发现施用棉隆和粉红螺旋聚孢霉可有效防治黄瓜枯萎病[23]。

目前，虽对5406放线菌开展了一系列的研究，还没有试验表明5406放线菌对西瓜的防病促生作用。因此，本试验设计研究5406放线菌对西瓜幼苗的生长及对西瓜枯萎病的防控效果，为5406放线菌菌剂在西瓜田间生产施用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

5406放线菌：购自中国农业微生物菌株保藏管理中心(ACCC)。

西瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.niveum(F1)：由北京市农林科学院植物保护环境保护研究所保存。

粉红螺旋聚孢霉(Clonostachysrosea)(GR02)：由北京市农林科学院植物保护环境保护研究所保存。

1.1.2 供试品种

西瓜种子：京研益农京阑F1。

枯萎病感病西瓜品种“YX”：由北京市农林科学院蔬菜研究中心西瓜课题组提供。

1.1.3 供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：200 g土豆、20 g葡萄糖、15～20 g琼脂，pH=7.2～7.4，定容至1 L。

马铃薯葡萄糖培养基(PD)：200 g土豆、20 g葡萄糖、pH=7.2～7.4，定容至1 L。

种子培养基：蛋白胨40 g、蔗糖15 g、甘油15 mL、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCO30.5 g、NaCl 0.5 g、KH2PO40.5 g。

5406发酵培养基：豆粕粉20 g、高峰淀粉酶0.05 g、玉米淀粉30 g、NaCl 7.5 g、葡萄糖10 g、蛋白胨6 g、CaCO34 g、(NH4)2SO42.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、KH2PO40.3 g[24]。

粉红螺旋聚孢霉(GR02)发酵培养基：土壤400 g、麸皮800 g、玉米芯350 g、水600 g，混匀后121 ℃灭菌30 min。

1.2 5406放线菌抑菌活性测定

将西瓜枯萎病病菌活化于PDA平板上，放置25 ℃培养箱中培养5～7 d后，取7 mm菌饼接种于平板中央，两侧等距接种5406放线菌，未接种病原菌平板作为空白对照，重复3次，置于25 ℃培养箱培养，观察其对西瓜枯萎病菌的抑制效果。

抑菌率=[(对照病原菌直径-与拮抗菌对峙的病原菌直径)/对照组病菌直径]×100%

(1)

1.3 育苗

将西瓜种子消毒处理后，置于65 ℃水中浸泡40 min，降至室温后继续浸泡培养3 h，将种子置于内含润湿滤纸的无菌培养皿内，随时洒水保持湿度，28 ℃培养催芽后，将露白的种子播入育苗盘中，待幼苗长至两叶一心时移至营养钵中。

1.4 菌剂制备

5406菌剂制备：将保存于-80 ℃菌种活化于PDA平板，28 ℃，培养7 d，纯化后菌丝及孢子刮下，接种于种子培养基中，28 ℃，180 r/min，培养36 h后，按8%接种量转接到发酵培养基中继续培养36 h，发酵完成后，干燥并粉碎，留以备用。

西瓜枯萎病菌孢子悬液制备：将纯化好的菌株F1菌饼倒置于PDA平板，28 ℃，培养3 d后接种于马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)中，28 ℃，200 r/min培养7 d，调至孢子浓度为5×106cfu/mL[25]。

粉红螺旋聚孢霉(GR02)菌剂制备：挑取生长好的GR02接种到PD液体培养基中，25 ℃，180 r/min，培养24 h后按体积分数10%转接到发酵培养基中，培养14 d，使孢子量达到4×109cfu/mL。

1.5 不同剂量5406放线菌菌剂对西瓜幼苗的促生作用

营养土经高压灭菌后分装入育苗盘，按每营养钵含0 g(CK)和0.25 g浓度为2.5×108cfu/g、0.5 g浓度为5×108cfu/g、1.0 g 浓度为1×109cfu/g 5406放线菌菌剂的量[26]，菌剂与土充分混匀后分装至营养钵中，选取长势较为一致的西瓜幼苗移栽，每个处理3次重复，15 d后，对西瓜幼苗的生长指标(株高、茎粗、植株鲜重和干重)进行测定。

株高：用直尺测量植株茎基部到顶部的距离。

茎粗：用游标卡尺测量中部茎粗度。

植株鲜重与干重：植株洗净后用电子天平测量其鲜重，65 ℃烘干，测定干重。

1.6 不同剂量5406放线菌菌剂对西瓜枯萎病盆栽防效的测定

待西瓜幼苗长出两片真叶时，采用浸根接种法进行盆栽试验[27]。试验处理如下：分别为清水对照(CK)、单独接种5406放线菌菌剂(CK+5406)、单独接种西瓜枯萎病菌(F1)、接种西瓜枯萎病菌(F1)与0.25 g 5406放线菌菌剂(F1+0.25 g 5406)、接种西瓜枯萎病菌(F1)与0.5 g 5406放线菌菌剂(F1+0.5 g 5406)以及接种西瓜枯萎病菌与1.0 g 5406放线菌菌剂(F1+1.0 g 5406)。每个处理3次重复，每个重复共30株。处理10 d后参照Martyn等的分级标准[28]调查统计发病植株病情，并计算枯萎病病情指数和防治效果。

发病率=(发病株数/总株数)×100%

(2)

病情指数=[∑(病级株数×代表值)/(株数总和×发病最重级的代表数值)]×100

(3)

防治效果=[(对照病情指数-处理病情指数)/

对照病情指数]×100%

(4)

1.7 5406放线菌菌剂对西瓜枯萎病的田间防效测定

于北京大兴实验田进行试验，小区面积为16.2 m2(6 m×2.7 m)，外围设置保护行，采用随机区组设计试验，3个处理条件如下。

(1)对照(CK)：接病对照。

(2)基施+灌根处理：基施1株苗0.1 g粉剂，667 m2用量为3 kg菌剂，灌根5406发酵液(1×108cfu/mL)剂量为稀释60倍后，每1株苗灌根150 mL。

(3)灌根处理：灌根5406发酵液(1×108cfu/mL)稀释60倍后，1株苗灌根150 mL。

每处理重复3次，期间每间隔10 d进行一次灌根处理，共3次，30 d后调查(每个处理调查30株)植株病情指数和防治效果。

1.8 5406放线菌与粉红螺旋聚孢霉复配菌剂对西瓜枯萎病的防治效果

通过盆栽试验利用复配菌剂对其进行有效防治，期望得到更好的效果。采用5406放线菌菌剂5×108cfu/g和粉红螺旋聚孢霉(GR02)含量5×108cfu/g，1∶1充分混匀，盆栽试验方法同1.6，试验共分为五个处理方式：清水对照(CK)，单独接种西瓜枯萎病菌(F1)，单独接种5406放线菌菌剂(5×108cfu/g)，单独接种粉红螺旋聚孢霉GR02(5×108cfu/g)，复配菌剂中5406放线菌菌剂含量为2.5×108cfu/g，粉红螺旋聚孢霉GR02含量为2.5×108cfu/g。每个处理3次重复，每个重复30株，处理10 d后统计病情指数和防治效果。

1.9 数据分析

数据统计分析利用Excel 2010整理原始数据，同时采用SPSS 22.0软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 5406放线菌抑菌活性测定结果

采用对峙法培养4 d后，可明显观察到枯萎病菌菌丝生长受到了抑制，抑菌率为57.50%(图1)。表明5406放线菌对西瓜枯萎病菌有明显的抑制效果。

2.2 不同剂量5406放线菌菌剂对西瓜幼苗的促生作用

不同剂量处理的西瓜幼苗的株高、茎粗、鲜重、干重有显著差异(表1)，对于株高和茎粗的影响中，0.25 g和0.5 g 5406放线菌菌剂显著高于其他两个处理，且两处理间具有显著差异，1.0 g 5406放线菌菌剂的处理较低于CK，差异不明显，对于鲜重和干重的影响中，0.5 g 5406放线菌菌剂处理显著高于其他处理，0.25 g 5406放线菌菌剂处理显著高于1.0 g 5406放线菌菌剂处理组和CK，而CK与1.0 g 5406放线菌菌剂的处理差异不显著，根据上述结果表明，施用孢子量为5×108cfu/g的0.5 g 5406放线菌菌剂促进西瓜幼苗的生长效果最明显。

表1 不同剂量5406放线菌菌剂对西瓜幼苗生长的影响Table 1 The effect of different content 5406 inocula on the growth of watermelon seedlings

2.3 不同剂量5406放线菌菌剂对西瓜枯萎病盆栽防效的测定

接病菌株大约7 d开始发病，经F1处理后幼苗整株明显呈褐色枯萎(图2)，F1+5406放线菌菌剂处理的西瓜幼苗病害程度明显降低，且新叶无病症，表明5406放线菌菌剂对西瓜枯萎病有明显的防治效果。

图2 5406放线菌对西瓜枯萎病的防治效果Fig.2 Control effects of 5406 actinomycetes on fusarium wilt of watermelon

由表2可知，接种5406放线菌菌剂的处理相比单接病原菌F1处理显著降低了发病率和病情指数，其中F1+0.5 g 5406放线菌菌剂处理与单接种F1处理相比，发病率降低了70.12%，病情指数降低了41.44，效果最好，F1+0.25 g 5406放线菌菌剂处理与单接种F1处理相比，发病率降低了64.34%，病情指数降低了35.54，F1+1.0 g 5406放线菌菌剂处理与单接种F1处理相比，发病率降低了67.80%，病情指数降低了39.22。不同接种量处理间也存在差异，接种0.5 g 5406放线菌菌剂的处理组防治效果高于接种0.25 g和1.0 g处理组，防治效果可达60.44%，效果最好，接种1.0 g 5406放线菌菌剂处理的防治效果显著高于接种0.25 g处理组，其防治效果为53.29%，而0.25 g 5406放线菌菌剂处理防治效果为48.29%。三种接种5406放线菌菌剂均可抑制西瓜枯萎病，综合上述结果，施用孢子量为5×108cfu/g的0.5 g 5406放线菌菌剂为最优剂量。

表2 不同处理对西瓜枯萎病的防治效果Table 2 Control effects of different treatments on fusarium wilt of watermelon

2.4 5406放线菌菌剂对西瓜枯萎病田间防效的测定

在田间针对5406放线菌菌剂对西瓜枯萎病的防效进行测定后发现，经过基施和灌根处理后，具有较高的防治效果，可达62.12%(表3)，病情指数较对照显著下降了35.00，灌根处理也具有一定防治效果，但效果较基施和灌根处理组差，防治效果达32.29%，病情指数降低了18.19，防治效果不明显。结果表明5406放线菌菌剂不仅在室内具有良好的抑菌效果，而且在田间也可保持较好的生物活性。

表3 不同处理对西瓜枯萎病的田间防效Table 3 Field effects of different treatments on fusarium wilt of watermelon

2.5 5406放线菌和粉红螺旋聚孢霉复配菌剂对西瓜枯萎病的防治效果

复配菌剂的盆栽试验结果表明复配菌剂处理组防治效果较好，显著高于单独接种5406放线菌菌剂处理组和单独接种粉红螺旋聚孢霉GR02菌剂处理组，较单独接种西瓜枯萎病菌F1处理组显著降低了发病率，防治效果可达68.24%(表4)，单独施用5406放线菌菌剂和单独施用粉红螺旋聚孢霉GR02菌剂发病率也明显降低，但二者间差异不显著，防治效果分别为61.89%和64.34%，从试验可以明显看出施用复配菌剂比单独施用菌剂防病效果好，可以后续开发并大量使用。

表4 5406放线菌和粉红螺旋聚孢霉复配菌剂对 西瓜枯萎病的防治效果Table 4 Control effect of 5406 actinomycetes combination with Clonostachys rosea on fusarium wilt of watermelon

3 讨论和结论

放线菌菌剂具有易长期保存，便于运输等特点。5406放线菌作为一种生防菌，能够产生抗菌素，分泌细胞分裂素等刺激植物生长的物质，促进叶绿素含量的增加，对植物根系的生长有促进作用，并具有提高酶的生物活性，缓解连作障碍，促进土壤中氮、磷的转化等特点，现已逐步应用于农业生产中。

研究通过平板对峙法，测定5406放线菌对西瓜枯萎病菌具有明显抑制效果，并通过试验表明5406放线菌菌剂对西瓜幼苗有促生效果，使西瓜的株高、茎粗、鲜重及干重含量均明显增加，其中，孢子量为5×108cfu/g的0.5 g 5406放线菌菌剂的处理效果最明显，为最佳施用剂量。本试验结果与峥嵘[16]的研究结果相符，表明5406放线菌菌剂对幼苗的促生作用具有普遍性。

目前，大田中常以多菌灵，甲基托布津等化学药剂抑制西甜瓜枯萎病，此方法虽见效快，易操作，但长期施用单一药剂易产生农药残留，危害人类健康并造成环境污染[29]。因此发现并研究高效无毒害的生物菌剂是科研人员的重要任务。任迁琪等[2]发现链霉菌属F32对西瓜枯萎病有较好的防效，利迪链霉菌[30](S.lydicus)也可抑制西瓜枯萎病的生长。本试验所施用5406放线菌菌剂对西瓜枯萎病的防治效果较好，其中0.5 g 5406放线菌菌剂的防效可达60.44%。通过田间防效测定发现5406菌剂基施和灌根处理时，西瓜枯萎病病情指数显著降低了35.00，防治效果可达62.12%，结果表明在大田此生防菌株也具有较好的抑菌活性。

综上结果所示，施用5406放线菌菌剂具有促进西瓜幼苗生长的作用，同时对西瓜枯萎病有较好的抑制效果，其中孢子量为5×108cfu/g的0.5 g 5406放线菌菌剂的防病促生效果最好；在大田试验中也有明显防治成效，基施和灌根处理防效可达62.12%，复配菌剂5406放线菌和粉红螺旋聚孢霉(GR02)对西瓜枯萎病的防治效果优于单一菌剂处理，达到68.24%。但目前使用微生物菌剂仍处于探索阶段，且5406放线菌抗菌机制暂不清晰，因此还将对其进一步研究，为后续抑菌物质的开发和应用微生物菌肥的应用奠定基础。