SNX10 在石骨症中的分子机制研究进展*

周卫军 唐尚坤 沈晔 陈敏杰

石骨症（osteopetrosis）又称骨硬化症，是一种罕见的遗传性疾病，是由于骨吸收障碍导致的骨密度增加为主要特征的全身性疾病。根据遗传形式，石骨症可以分为3 种类型：常染色体隐性遗传（autosomalrecessive osteopetrosis，ARO）、常染色体显性遗传（autosomal dominant osteopetrosis，ADO）和伴X 染色体遗传[1]。本文将从ARO 型石骨症的主要临床表现出发，并着重以分选连接蛋白10 型（sorting nexin 10，SNX10）突变引起的ARO 型为例，阐述其研究现状。

ARO 的发病率约为25 万分之一，并且存在地域性与遗传性差异，在特定的地区与人群中，ARO 有着相对较高的发病率。ARO 也被称作恶性婴儿型，大多数患者发病于出生后数月，此类婴儿的寿命在10 年以内，少数可以达到20年以上。而ADO 的发病率相对较低，多于青少年或者成年时期发病。ADO 的发病严重程度呈现了较高的可变性，轻者无症状，故又称温和型，但也有少数儿童时期即起病的患者，其表型常常较为严重[2]。相比之下，伴X 染色体遗传的石骨症是极其罕见的[3-6]。

根据发病机制，石骨症分为两种类型：一种为OCL 缺少型，主要影响OCL 的分化过程，涉及此型的主要基因突变类型有RANK、RANKL；另一种为OCL 丰富型，主要影响OCL 的溶骨功能，涉及此型的主要基因突变类型有TCIRG1、CLCN7、SNX10、OSTM1、PLEKHM1、CAII，其中SNX10 是参与OCLV-ATP 酶囊泡运输的关键蛋白[7]。作为一种最新被发现的ARO 相关基因，近些年来，若干SNX10 突变型石骨症病例被陆续报道，其突变类型也被依次阐明。尽管如此，对于SNX10 突变型石骨症的机制研究尚不完全清楚，这对该型石骨症患者的治疗及预后的改善至关重要。因此，本文将对SNX10 分子机制做一综述。

1 SNX10 的结构及功能

SNXs 家族包含30 多个成员，均含有PX 结构域。该家族蛋白通过PX 结构域可以结合特定的磷酸化磷脂酰肌醇（phosphorylated phosphatidylinositols，PIs），并将蛋白质靶向富含PI 的膜，从而参与蛋白质分选、运输和体内稳态调节。其中，SNX10 是该家族中一种仅含有PX 结构域的蛋白[8-10]，其表达产物在胞质、内小体膜、外周膜蛋白、细胞质侧、细胞骨架、微管组织中心、内质网等处都有分布[11]。

SNX10 在RANKL 诱导的破骨分化过程中高表达，其中最主要表达于内质网与细胞核。免疫组化分析发现，SNX10与TRAP、MMP-9 存在共定位，并且SNX10 还参与MMP-9的分泌（具有降解胞外基质作用）[11]。此外，在细胞学实验中沉默OCL 的SNX10 基因后发现，破骨特异性的基因表达明显下降（TRAP、CTsk 及MMP-9）[12]。SNX10 与V-ATP酶也存在相互作用，介导了V-ATP 酶通过囊泡运输发挥作用[13]。再者，SNX10 可能参与褶皱边界（OCL 骨吸收功能区）的形成。在对最新一种SNX10 突变亚型的病例分析显示，患者破骨骨吸收功能出现障碍，但是OCL 的分化与肌动蛋白环的形成均正常，猜想这可能与SXN10 突变导致褶皱边界形成障碍有关[14]。综上所述，SNX10 在OCL 的囊泡运输、内小体稳态及破骨骨吸收中有着重要作用。

近来发现，SNX10 全身敲除还对小鼠类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的发生、发展有影响。由于OCL的成熟与分化是类风湿关节炎骨损伤的主要因素之一，因此抑制OCL 的活动理论上可以在一定程度上缓解RA 的进展。具体来说，SNX10 敲除主要导致了密闭功能区（sealing zone）的破坏，以及TRAP、CTSK 和MMP-9 分泌减少，以上症状均可以通过过表达SNX10 改善。对其机制研究发现，SNX10 敲除造成了内小体的过度酸化，从而加速了NFATc1的降解。然而，NFATc1 含量的下降影响了整合素3（肌动蛋白带形成的关键因子）及其下游蛋白的表达，如c-Src 和PYK2 的活动。这一系列的机制导致的OCL 功能的障碍，说明了SNX10 在破骨重吸收中发挥了重要作用[15]。

除了在OCL 中的作用，SNX10 还存在其他组织表达。其中，胃壁细胞也高表达SNX10。当SNX10 发生突变时，胃液pH 上升，钙吸收出现障碍，游离血钙降低，进而导致了两种疾病表现：石骨症（OCL 功能障碍）、佝偻病（钙吸收障碍）。研究发现，全身SNX10 敲除的小鼠出现了严重石骨症症状，如严重生长滞后、牙齿萌出障碍、高骨骼密度，以及骨髓腔的缺损，并且合并严重的佝偻病症状（如低血钙、高PTH）。这种综合石骨症与佝偻病的合并症，也叫作石骨症化佝偻病（osteopetrorickets），是一种全身正钙平衡下的骨质钙化不足的疾病，其发病可能与OCL 失去维持钙磷稳态调节能力有关。此外，此类全敲除小鼠还出现了消化道畸形（主要是胃）：出血性坏死、胃壁细胞受损、胃pH上升。在外源性给予钙剂后，以上消化道症状有所改善。然而，在SNX10 的OCL 条件性敲除的小鼠中情况完全不同，仅仅出现了石骨症表现，而无佝偻病症状（低血钙、消化道畸形等），这就印证了SNX10 在不同组织存在特异性表达，并且发挥不同的功能。其中，SNX10 表达于胃壁细胞中，参与胃的泌酸作用与钙的吸收；而表达于OCL 中，参与破骨骨吸收过程。逆转录病毒介导的SNX10 过表达实验，反面印证了该观点。无论是全身性敲除，还是条件性敲除SNX10的小鼠，其石骨症或石骨症佝偻病的症状都通过过表达SNX10 得到大幅度改善[8，16-18]。

Stein 等[19]新构建了还原人R51Q 突变的ARO 小鼠模型，该模型鼠并未患有石骨症性佝偻病，即胃内pH 以及血Ca2+、PTH 水平都是正常的，仅表现出：显著增高的骨量，骨髓腔严重狭小，严重的牙齿萌出受限。此外，组织细胞学发现，R51Q 小鼠股骨和椎骨OCL 数量与吸收面积显著减少；后在R51Q 小鼠脾脏来源的破骨细胞体外培养中，发现其褶皱边界形成障碍、吸收区酸化不足；然而，在体内实验发现Ⅰ型胶原交联C 端肽（CTX）水平是正常的，说明可能CTX 不能很好反映体内的骨吸收，因此进一步对成骨研究发现：骨细胞数量是正常甚至增加的、但是成骨水平并没有明显变化。这就从侧面提示，该变化（吸收区酸化不足）可能与OCL 功能不足相关。

除此以外，SNX10 还能增强机体的抗感染能力。SNX10通过介导巨噬细胞中mon1-ccz 1 复合物的转运，促进了rab5和rab7 的转化，进而诱导早期内小体的成熟，最终促进巨噬细胞的成熟，从而增强了小鼠的抗感染能力。实验发现，小鼠在李司特氏菌感染后，SNX10 表达明显上调。同样的结果在SNX10 全敲的小鼠中得到呈现，该类小鼠死亡率较高、出现更严重的菌血症和肝脾损伤，而过表达SNX10 后，小鼠的抗感染能力明显增强[20]。

2 已知SNX10 突变类型

目前研究发现，SNX10 突变型ARO 多种类型的突变，其中大多数突变都是作用于SNX10 的PX 结构域的表达，从而影响了蛋白间或蛋白与脂质的相互作用。

2.1 c.46C＞T（g.69102C＞T）

2012 年，研究者在3 个无血缘关系的巴勒斯坦籍的ARO患者中发现了SNX10 的突变——Arg16Leu，Arg 坐落于1链上，是发生在外显子3（高度保守残基）中的错义突变，导致转录过早终止，从而影响了SNX10分子二聚体的形成[21]。

2.2 c.95A＞C（Tyr32Ser）

（g.69151A＞C）目前已有3 个不同家庭的病例，都具有正常的父母和兄弟。坐落于Tyr32 2 链，是 折叠与 螺旋连接的疏水内核，该突变将影响PX结构域的内部二级结构与相邻 折叠的结构，因此影响了蛋白的相互作用及与磷酸基团的结合[22]。

2.3 c.111+5G＞C

（g.69746G＞C）是SNX10 外显子3 上的一种突变[22]。

2.4 c.212+1G＞T（g.72742G＞T）

2013 年，首次由Pangrazio 在3 个无血缘关系的瑞典家庭发现[22]。由于SNX10 c.212+1G＞T 突变造成的外显子4 隐匿剪接位点激活与异常剪接。从而干扰细胞内皱褶边界的形成而导致OCL 功能失调。2017 年，科学家首次通过一位41岁女性患者的真皮成纤维细胞诱导分化出了携带此类纯合突变诱导多能干细胞（induction pluripotent stem cells，iPSCs），这是今后研究SNX10 突变型ARO 极其重要的基础[23]。

2.5 c.152 G＞C（Arg51Pro）

（g.72681G＞C）是SNX10 外显子3 上的一种突变。Arg51结合于相邻1 与3 折叠间，该突变将改变了PX 结构域主链构象，导致蛋白相互作用的障碍，对患者OCL分离研究发现：广泛性细胞质空泡化、突变体SNX10 的亚细胞异常分布以及细胞重吸收功能障碍[24]。

2.6 c.43delG（Val15Phe）

2016 年，Akbar 首次在一个近交家庭发现了此突变，育有一儿一女。患病男孩死于6 岁，然而女孩活了17 岁。外显子2 上的鸟苷酸缺失，导致移码突变，造成在缺失点后的第30 个氨基酸处过早终止翻译[25]。

2.7 c.24+36T＞A 及c.112-84G＞A

2019 年，在对土耳其患者的Sanger 测序分析，验证了该患者内含子3 以及内含子4 上突变的存在[26]。

2.8 c.284G＞A（Arg95His）

2016 年，全外显子测序技术的应用，一种新型SNX10纯合突变——（Arg95His）被阐明[27]。

3 SNX10 相关ARO 临床案例

相关临床案例如表1-3 所示。

表1 SNX10 Exon3 c.152 G＞A 突变案例[24]

表2 SNX10 c.212+1G＞T 突变病例[14，22，24-25]

表3 SNX10 其他突变病例[21，25，27]

4 目前的治疗方法――HSCT

由于OCL 是单核巨噬细胞来源的髓系细胞，因此造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）是目前针对OCL 导致的石骨症唯一有效的治疗方法，但需要在明确诊断后尽早进行。目前已有几例成功的案例[28-29]（见表4）。此外，需要注意的是，HSCT 有严格的手术指征与禁忌证——并发神经系统退行性疾病的患者不适合HSCT治疗，因为神经退行并非继发于骨骼变化，因此对于确诊的SNX10 突变患者，HSCT 前同样需要进行严格的MRI 和脑电图检测，排除此类情况[1]。

根据Stepensky 等[28]的研究，HSCT 的疗效如下：存活率为6/7，移植后现存平均年龄4 岁（小至1 岁，大至8 岁），患者的临床状况与生活质量得到较大改善，尤其是血液异常改善显著（不再需要输血或血小板）。其中5 位患者在移植后1 个月，查体中性粒细胞＞0.5×109/L，血小板为20×109/L。患者的视力和听力也得到较大提高。所有患者的骨密度和骨变形在数月和数年间都有改善，移植后1 年几乎没有病理性骨折发生，能正常生活和工作。术后并发症：①排异反应。1 位患者移植后出现了排异反应移植，后多次移植。最终在3 次移植后，死于巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染和肺动脉高压；1 位患者术后出现了2-3 级急性移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD），治疗后好转。②感染性并发症。5 位患者出现细菌败血症或菌血症、3 位出现了CMV 活动、1 位出现EBV 活动。此外，高钙血症、病理性骨折偶尔可见。

HSCT 的治疗效果在多位患者中得到印证（见表4）。①R51Q 突变的男孩，患者骨折、矮小、额骨隆起、一侧失明、脾肿大被确诊为ARO，HSCT 后恢复良好，并已经能够恢复学业[28]。②纯合70kb SNX10 缺失的女孩，9 岁出现右侧股骨骨髓炎，伴有广泛骨密度增加，测序提示7p15.2上70kb 缺失突变型ARO，并于13 岁出现止痛剂无效的严重骨痛。行HSCT 治疗，疼痛逐渐减轻，骨密度明显改善。术后2 年，血液及影像学检查正常[29]。

表4 SNX10 型ARO 的HSCT 前后对比[28-29]

5 总结

石骨症是一种罕见的、具有遗传异质性的骨硬化疾病，其中SNX10 突变型是一种新发现的常染色体隐性遗传型石骨症。鉴于该型石骨症高度婴儿致死性与较高发病率以及对于新型基因SNX10 研究的不足，因此研究SNX10 突变型ARO 具有广阔的前景和深远的意义[1，7]。随着对SNX10 结构功能的揭示，SNX10 型石骨症的发病机制将会更加明了，这也为日后诊治工作打下了基础。