蓬子菜化学成分的分离与鉴定

孙志伟, 张文君

(哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076)

蓬子菜(GaliumverunL.)为茜草科(Rubiaceae)拉拉藤属(Galium)药用植物，入药部位为其干燥全草，蓬子菜具有行血祛瘀、消肿通经、清热抗炎以及利湿止痒之功效[1-3].本课题组前期药效学实验表明体积分数60%乙醇(EtOH)洗脱部位为治疗周围血管病的有效部位[4-5]，经紫外分光光度法测定，含总黄酮量可达58%.为进一步展开蓬子菜总黄酮活性的物质基础研究，本实验采用硅胶柱色谱、HPLC等现代分离技术与方法对该部位进行分离，并通过理化分析、1H-NMR、13C-NMR数据解析，鉴定了该10个化合物的化学结构，见图1.

图1 蓬子菜的化合物结构

1 仪器与材料

超导核磁共振光谱用INOVA-500、INOVA-400和Bruker-400型超导核磁共振光谱仪(TMS为内标)；制备HPLC采用Waters公司的Delta-600-2487型；分析型色谱柱，大连依利特公司Hypersil ODSⅡ(5μm 4.6×200 mm)；制备型色谱柱，制备色谱柱为Zorbax-SB-C18(9.4 mm×250 mm)；柱色谱硅胶，青岛海洋化工厂(140～200目，200～300目)；薄层色谱硅胶板，德国Merck公司(Silica gel60F254)；硅胶(青岛海洋化工厂，140～200，200～300目)；柱色谱用反相ODS(ODS-AM)为YMC公司产品；色谱层析用化学试剂为分析纯(天津试剂一厂).

本实验所用蓬子菜采自安达市，由哈尔滨商业大学张德连副教授鉴定为茜草科拉拉藤属植物蓬子菜(GaliumverunL.).

2 提取分离

蓬子菜干燥全草10 kg粉碎后用体积分数70%EtOH回流提取2次，每次2 h，合并提取液，减压回收EtOH后，将其浓缩物以体积分数20%EtOH稀释，通过AB-8大孔树脂柱，依次用体积分数20%EtOH、60%EtOH、95%EtOH洗脱，洗脱液减压浓缩得到各有效部位.

体积分数60%EtOH有效部位干法上样，以二氯甲烷-甲醇为洗脱溶剂，二者比例依次为100∶1、100∶2、100∶5、100∶10、100∶20、100∶40、100∶100.每个梯度的洗脱液用薄层板检测，合并相似的洗脱液，共得到7个洗脱流份(Fr.1～Fr.7).流分Fr.4经Sephadex LH-20色谱柱，以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱得到流分Fr.4.2，再经中低压制备色谱柱MPLC，以甲醇-水(20%甲醇-100% 甲醇)梯度洗脱得Fr.4.2.1-Fr.4.2.4和化合物1和8；流分Fr.4.2.1经硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(40∶1-10∶1)梯度洗脱得到化合物10、7和流分Fr.4.2.1.1.流分Fr.4.2.1.1经制备HPLC(15%甲醇/水，1.5 mL·min-1)得到化合物9和6；流分Fr.4.2.2经硅胶柱层析二氯甲烷-甲醇(50∶1-1∶1)梯度洗脱得到化合物3和流份Fr.4.2.2.1，Fr.4.2.2.1经制备HPLC(45%甲醇，1.5mL·min-1)得到化合物4；流分Fr.4.2.4经硅胶柱层析二氯甲烷-甲醇(100∶1-30∶1)梯度洗脱得到化合物5和2.

3 结构鉴定

化合物2：淡黄色粉末，mp 305～307 ℃，HCl-Mg粉反应呈阳性，Molish反应呈阴性，推测可能为黄酮.1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)谱中，δ：12.48(1H，s，5-OH), 10.77(1H，brs，7-OH)，9.75(1H，br s，4′-OH)和9.45(1H，br s，3-OH)处可观察到4个酚羟基质子信号；7.77(1H，d，J=2.0，H-2′)，7.70(1H，d，J=8.5，2.0 Hz，H-6′)和6.95(1H,d,J=8.5Hz,H-5′)处可观察到黄酮B环ABX偶合的3个氢质子信号；6.49(1H，d，J=2.0，H-8)和6.21(1H，J=2.0，H-6)处为黄酮A环间位偶合的质子信号；3.87(3H，s，3′-OCH3)为甲氧基信号；13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)谱中，δ：175.83(C-4)，147.31(C-2)，135.78(C-3)，归属为C环上3个碳信号；163.87(C-7)，160.65(C-5)，156.11(C-9)，102.99(C-10)，98.17(C-6)和93.55(C-8)为A环上的碳信号；148.76(C-4′)，146.57(C-3′)，121.68(C-1′)，121.94(C-6′)，111.67(C-5′)，115.50(C-2′)为B环上的碳信号；55.71(3′-OCH3)为甲氧基碳信号.以上数据与文献[8]报道一致，故鉴定化合物为异鼠李素(isorhamnetin).

化合物3：无色针状结晶(MeOH)，mp230～232 ℃，HCl-Mg粉反应呈阳性，四氢硼钠反应呈阳性，Molish反应呈阴性，推测为二氢黄酮类化合物.1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)谱中，δ：12.14(1H，s，5-OH),10.84(1H，s，7-OH)和9.12(1H，s，3′-OH)处可观察到酚羟基质子信号；6.92(1H，s，J=2.0Hz，H-2′)，6.93(1H，d，J=8.3Hz，H-5′)和 6.87(1H，dd，J=2.0，8.3Hz，H-6′)为黄酮B环ABX偶合系统氢质子信号；5.90(1H，d，J=2.1Hz，H-6)和5.89(1H，d，J=2.1Hz，H-8)处为黄酮A环间位偶合质子信号；5.42(1H，dd，J=12.4，3.0Hz，H-2)为二氢黄酮2位氢质子信号，3.76(3H，s，4′-OCH3)为甲氧基质子信号，3.20(1H，dd，J=17.1，12.4Hz，H-3a)和2.69(1H，dd，J=17.1，3.2Hz，H-3b)处为二氢黄酮3位氢质子信号；13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)谱中，δ：196.15(C-4)，78.18(C-2)，42.00(C-3)和处可观察到二氢黄酮C环的3个碳信号；166.61(C-7)，163.43(C-5),162.76(C-9)，101.76(C-10)，95.78(C-6)和94.96(C-8)，为二氢黄酮A环碳信号；131.10(C-1′)，114.01(C-2′)，146.41(C-3′)，147.85(C-4′)，111.93(C-5′)和117.64(C-6′)为二氢黄酮B环的碳信号；55.62(-OCH3)处为甲氧基碳信号.综上数据与文献[9]相关数据一致，故鉴定化合物为橙皮素(hesperetin).

化合物4：淡黄色针晶(MeOH)，mp 276～278 ℃，HCl-Mg粉反应呈阳性，Molish反应呈阴性，推测为黄酮类化合物.1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)谱中，δ：12.50(1H，s，5-OH),10.78(1H，brs，7-OH), 10.13(1H，brs，4′-OH)和9.40(1H，brs，3-OH)为酚羟基质子信号；8.06(2H，d，J=8.8，2.0Hz，H-2′，6′)和6.89(2H，d，J=8.8，2.0Hz，H-3′，5′)处为黄酮B环AA′BB′偶合系统的质子信号；6.11(1H，d，J=2.0Hz，H-6)和6.43(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)处为黄酮A环6,8位间位取代质子信号.13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)谱中，δ：175.86(C-4)，146.76(C-2)，135.63(C-3)归属为C环上3个碳信号；163.85(C-7)，160.68(C-9)，156.14(C-5)，103.01(C-10)，98.17(C-6)，93.44(C-8)为A环上的碳信号；159.15(C-4′)，129.47(C-2′，6′), 121.64(C-1′)，115.40(C-3′，5′)为B环上的碳信号.与文献[10]相关数据进行比较，二者基本一致，鉴定该化合物为山奈酚(Kaempferol).

化合物5：黄色粉末，mp 314～317 ℃，HCl-Mg粉反应呈阳性，Molish反应呈阴性，推测可能为黄酮.1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)谱中，δ：12.51(1H，brs)，10.78(1H，brs)，9.58(1H，brs)和9.37(2H，brs)为5个酚羟基质子信号；δ：7.69(1H，d，J=2.2 Hz，H-2′)，7.55(1H，d，J=8.0，2.2 Hz，H-6′)和6.89(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)为黄酮B环ABX偶合系统的氢质子信号；6.42(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)和6.20(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)处可观察到黄酮A环间位偶合的质子信号；13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)谱中，δ：175.80(C-4)，146.74(C-2)和135.69(C-3)归属为C环上的碳信号；163.84(C-7)，160.68(C-5)，156.09(C-9)，103.00(C-10)，93.30(C-8)，98.14(C-6)为A环上的碳信号；147.74(C-4′),145.01(C-3′)，121.91(C-1′)，119.93(C-6′)，115.56(C-5′)，115.02(C-2′)为B环上的碳信号.综合以上数据与文献[11]相关数据进行比较，二者基本一致，故确定化合物为槲皮素(quercetin).

化合物6：淡黄色粉末，mp 256～258 ℃，HCl-Mg粉反应呈阳性，Molish反应呈阴性，推测为黄酮类化合物.1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)谱中，δ：12.95(1H，s,5-OH)，10.81(1H，brs，7-OH)和9.53(1H，brs，3′-OH)为酚羟基质子信号；7.55(1H，d，J=8.5，2.3 Hz，H-6′)，7.43(1H，d，J=2.3Hz，H-2′)和7.09(1H，d，J=8.5 Hz，H-5′)处可观察到黄酮B环上ABX偶合系统的质子信号；6.76(1H，s，H-3)为黄酮C环烯氢质子信号；6.46(1H, d，J=2.0Hz，H-8)和6.19(1H,J=2.0Hz，H-6)处可见黄酮A环6，8位间位取代质子信号；3.88(3H，s)为甲氧基质子信号.13C-NMR(DMSO-d6，400 MHz)谱中，δ：181.65(C-4)，163.46(C-2)和103.70(C-3)归属为C环上的碳信号；164.20(C-7)，161.43(C-9)，157.27(C-5)，103.47(C-10)，98.84(C-6)，93.86(C-8)为A换上的碳信号；151.07(C-4′)，146.73(C-3′)，122.96(C-6′)，118.66(C-1′)，112.89(C-2′)，112.06(C-5′)为B环上的碳信号；55.70(4′-OCH3)为1个甲氧基碳信号.与文献[12]相关数据进行比较，二者基本一致，鉴定该化合物为香叶木素(Diosmetin).

化合物7：黄色无定形粉末，mp 252～254 ℃，HCl-Mg粉反应呈阳性，Molish反应呈阳性，推测可能为黄酮苷.1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)谱中，δ：12.95(1H，s，5-OH)，9.47(1H，s，3＇-OH)为两个酚羟基质子信号；7.46(1H，brs，Hz，H-2′)，7.11(1H，d，J=8.5 Hz，H-5′)和7.58(1H，dd，J=8.5 Hz，H-6′)为黄酮B环上ABX偶合系统的氢质子信号；6.84(1H，s，H-3)处可见黄酮C环上3位烯质子信号；6.46(1H，d，J=2.0Hz，H-6)和6.82(1H，d，J=2.0Hz，H-8)处可观察到一组黄酮A环间位偶合的氢质子信号；5.10(1H，d，J=7.3 Hz，H-1′′)处为糖的端基氢质子信号，3.87(3H，s，4′-OCH3)处可观察到1个4′位的甲氧基质子信号；13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)谱中，δ：181.92(C-4), 162.98(C-2)，105.36(C-3)为C环的3个碳信号；164.06(C-7)，161.10(C-5)，156.94(C-9)，103.79(C-10)，99.54(C-6)和 94.76(C-8)为A环碳信号；122.85(C-1′)，113.09(C-2′)，146.76(C-3′)，151.27(C-4′)，112.08(C-5′)和118.86(C-6′)为B环的碳信号；55.77(C-OCH3)处为甲氧基碳信号；对比化合物12发现，香叶木素母核的数据基本一致，区别主要在于糖的部分99.84(Glc-1)，73.08(Glc-2)，76.36(Glc-3)，69.50(Glc-4)，77.13(Glc-5)和60.57(Glc-6)共6个归属于葡糖糖的碳信号.与文献[13]中相关数据进行比较，二者基本一致，故鉴定该化合物为香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷(Diosmetin-7-O-β-D-glucoside).

化合物8：白色针晶(MeOH)，mp 211～213℃.1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)谱中，δ：11.99(1H，s)，9.37(1H，s)为苯环上3位和4位的羟基质子信号，7.41(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，6.17(1H，d，J=16.0Hz,H-8)为一组烯氢质子信号；7.04(1H，d，J=2.0Hz，H-2)，7.00(1H，dd，J=2.0，8.4 Hz，H-6)，6.76(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)为苯环上一组ABX偶合的质子信号；13C-NMR(DMSO-d6，400MHz)谱中，δ：167.89显示一个羰基碳信号；此外还含有一组不饱和碳信号148.08(C-7)，144.55(C-3)，145.50(C-4)，125.65(C-1)，115.07(C-5)，121.14(C-8)，115.70(C-2)，114.56(C-6).以上数据与文献一致[14]，故鉴定该化合物为咖啡酸(caffei acid).

化合物9：白色粉末，mp 204～206 ℃.1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)谱中，δ：7.42(1H，d，J=16.0，H-7′)和6.14(1H，d，J=16.0，H-8′)处可观察到呈反式双键的烯氢质子信号；7.04(1H，d，J=2.0,H-2′)，6.98(1H，dd，J=2.0，8.0，H-6′)和6.76(1H，d，J=8.0，H-5′)处可观察到苯环ABX偶合的3个氢质子信号；5.08(1H，q，J=6.8，H-3)，3.93(1H，brs，H-5)，3.57(1H，brs，H-4)和1.76-2.04(4H，m，H-2，6)处为奎宁酸质子信号；13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)谱中，δ：165.69(C-9′),114.23(C-8′)和144.70(C-7′)处可观察到α，β不饱和酮的3个碳信号；148.29(C-4′)，145.51(C-3′)，125.54(C-1′)，121.33(C-6′)，115.69(C-5′)和114.70(C-2′)处为ABX取代的苯环碳信号；174.90(C-7)，73.41(C-1)，70.83(C-3)，70.30(C-4)，68.00(C-5)，37.15(C-6)和36.16(C-2)处为苷化奎宁酸的碳信号.以上数据与文献[15]报道绿原酸的数据进行比较，二者基本一致，故鉴定该化合物为绿原酸(chlorogenic acid).

化合物10：无色针状结晶(氯仿)，mp 287～288 ℃.1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)谱中，δ：11.9(1H，s，28-OH)处可观察到28位羧基的羟基质子信号；5.12(1H，s，H-12)处为12位的烯质子信号；4.29(1H，d，J=5.1Hz，H-3)和2.11(1H，d，J=11.1 Hz，H-18)处分别是3和18位的氢质子信号；在1.04(3H，s)，0.75(3H，s)，0.87(3H，s)，0.68(3H，s)，1.23(3H，s)分别为23～27位的5个角甲基质子信号；0.91(3H，d，J=7.6Hz，29-CH3)和0.82(3H，d，J=6.0 Hz，30-CH3)处是29，30位的角甲基.13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)谱中，δ：178.23(C-28)为羧羰基碳信号；138.15(C-13)和124.54(C-12)处的一对烯碳信号；28.22(C-23)，15.19(C-24)，16.89(C-25)，17.00(C-26)，23.24(C-27)，16.05(C-29)，和21.04(C-30)的7个角甲基信号；76.79(C-3)为环上连氧碳信号；54.75(C-5)，52.34(C-18)，46.79(C-17)，47.98(C-9)，41.60(C-14)，38.47(C-8)，38.41(C-19)，38.47(C-20)，38.20(C-4)，32.67(C-1)，36.34(C-10)，36.49(C-22)，30.16(C-7)，29.02(C-21)，27.51(C-15)，27.00(C-2)，23.78(C-16)，23.24(C-11)，18.00(C-6)为一系列脂肪环上碳信号.综合以上数据与文献[16]报道熊果酸(ursolic acid)的数据一致.

4 结 语

本文对60%乙醇(EtOH)洗脱部位进行分离，通过使用不同色谱技术对其化学成分进行分离，根据理化性质及1H-NMR、13C-NMR等波谱学技术对所得化合物进行结构鉴定.经过硅胶层析得到7个流分，其中Fr.4流份的量最高(约占所有流份的2/3)，通过HPLC检测发现60%乙醇(EtOH)洗脱部位主要成分也多集中在Fr.4流份中，为了提高分离效率，本实验针对Fr.4流份进行系统分离.通过第一遍硅胶柱层析的馏分虽然分离效果较好，但吸附较为严重，样品损失较多，接下来分别通过Sephadex LH-20 和MPLC进行分离，馏分损失较少，分离效果较为理想，最终分离得到10个化合物：diosmetin-7-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside(1)、isorhamnetin(2)、hesperetin(3)、Kaempferol(4)、quercetin(5)、Diosmetin(6)、Diosmetin-7-O-β-D-glucoside(7)、caffei acid(8)、chlorogenic acid(9)、ursolic acid(10)，其中化合物1为首次从拉拉藤属植物中分离得到，丰富了蓬子菜化学结构信息，对阐明蓬子菜治疗周围血管病药效物质基础具有重要意义.