红参水提物中人参三萜在人源肠Caco-2细胞单层模型上的吸收转运研究

杨秀伟，周琪乐，杨雁芳，张友波，徐 嵬

北京大学药学院 天然药物学系 天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 100191

口服给药是临床上最常用的给药方式，具有相对安全以及患者依从性好等优势。药物经口服进入体内主要是通过小肠吸收，而肠上皮细胞屏障及酶系统是决定药物吸收程度的关键因素之一。从20世纪80年代，国外开始应用人结肠腺癌细胞系（human colon adenocarcinoma cell line，Caco-2）细胞建立药物肠吸收的体外模型，目前已被广泛应用于药物的体外吸收评价研究。Caco-2细胞来源于人体结肠腺癌细胞，在培养条件下可自发进行上皮样分化并可形成紧密联结，其形态学、标志酶的功能表达及渗透特征与小肠类似，具有易于培养、同源性好、体外吸收实验重现性好等优点[1]。

人参是驰名中外的大补中药之一，最简单的用药形式是“独参汤”，复杂的用药形式是通过辨证与其他中药配伍成复方应用。现代药理学研究表明，人参中的三萜类成分，包括其皂苷[2]，几乎反映了人参的全部药物学作用[3]。但有关红参中三萜类化合物的肠吸收评价研究甚少。众所周知，中药发挥疗效是其多成分协同作用的结果，单一活性成分的肠吸收不能完全反映单味药或其复方的肠吸收情况，因此中药单味药或复方的肠吸收研究是必要的。针对中药提取物肠吸收转运后待测物富集难、微量成分难检测的问题，本课题组建立了鼠尾胶原包被且给样量大的6 孔板Caco-2细胞单层模型[4]。为了从整体评价红参提取物复杂成分的肠吸收情况，本研究采用国际上公认的可以模拟小肠上皮细胞的Caco-2细胞单层模型（6 孔Transwell 板），对红参水煎液提取物的正丁醇萃取部位（人参总皂苷部分）进行体外小肠吸收转运评价研究，探索红参中人参三萜类成分在红参整体给药方式下的肠吸收情况，为红参的临床合理应用提供参考依据。

1 材料与仪器

1.1 细胞

Caco-2细胞株（ATCC #HTB-37）购自美国ATCC（American Type Culture Collection）。

1.2 药品及主要试剂

红参样品由长春加一健康食品有限公司（长春）提供，经北京大学药学院杨秀伟教授鉴定系由人参Panax ginsengC.A.Meyer 的根和根茎加工制成的红参，凭证标本（No.20131201JLRG）存放在北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室。

受试化合物对照品人参皂苷（G）-Ra1（1）[5]、G-Ra2（2）、G-Rb1（3）、G-Rb2（4）、G-Rb3（5）、G-Rc（6）、G-Rd（7）、G-Re（8）、G-Rg1（9）、G-Rg5（10）、G-Rg6（11）、G-Rg9（12）、G-Rh4（13）、G-Rk1（14）、G-Rk3（15）、G-Rs1（16）、G-Rs2（17）、G-Rs4（18）、G-F4（19）、G-Ro（20）、G-Ro 甲酯（21）、20-glu-G-Rf（22）、20(S)-G-Rf（23）、20(R)-G-Rf（24）、20(S)-G-Rg2（25）、20(R)-G-Rg2（26）、20(S)-G-Rg3（27）、20(R)-G-Rg3（28）、20(S)-G-Rh1（29）、20(R)-G-Rh1（30）、20(S)-G-Rs3（31）、20(R)-G-Rs3（32）、20(S)-NG-R2（33）、20(R)-NG-R2（34）、NG-R1（35）[6]、20(S)-G-Rf2（36）、20(R)-G-Rf2（37）、20(S)-PPT（38）、20(R)-PPT（39）[7]，由本课题组从生晒参或红参或人参茎叶中分离得到；竹节参皂苷IVa（CS-IVa，40，批号PS 14052106）购自成都普思生物科技有限公司；拟人参皂苷RT5（PG-RT5，41，批号MUST 15041410）和F11（PG-F11，42，批号MUST 15020311）购自成都曼思特生物科技有限公司。42 个化合物的对照品经HPLC 检测其质量分数均＞98%，其化学结构见图1。

图1 人参三萜的化学结构Fig.1 Chemical structures of ginseng triterpenoids

DMEM 培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，批号8120426）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，批号 1872295）、非必需氨基酸（nonessential amino acids，NEAA，批号2188976）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA，批号 2192749）和青霉素（penicillin）-链霉素（streptomycin）双抗（批号2257205）购自美国Gibco公司；Hank’s 缓冲溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）和二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自美国Sigma 公司；乙腈和甲醇均为质谱级（美国Avantor Performance Materials，Inc.）；乙酸铵（HPLC 级，LOT# BCBK6717V，美国Sigma-Aldrich 公司）。6 孔聚碳酯膜转运板（Transwell，#3414）、15 及50 mL 塑料离心管和25 cm2及75 cm2细胞培养瓶等均购自美国Corning Costar 公司。I型鼠尾胶原（RTC，批号SLBW1777）购自德国 Sigma 公司。实验用水由 Milli-Q Advantage A10 制水机（美国Millipore 公司）制备。

1.3 仪器

GALAXY B型CO2气体培养箱（英国RS Biotech公司）、JJT-1300 型超净工作台（北京昌平长城空气净化公司）、Evom 细胞电阻仪（美国World PrecisionInstrument 公司）、XDS-1 倒置显微镜（重庆光电仪器总公司）、GRX-9051B 型热空气消毒箱（上海福玛实验设备有限公司）、座式蒸汽压力灭菌锅（上海龙杰机械装备有限公司）、HZS-H 型恒温水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）、TDL-5-A型低速台式大容量离心机（上海安亭科学仪器厂），LGJ0.5 冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂）。

岛津LCMS-8050 超高效液相色谱-质谱仪，包括Nexera X2 UFLC 液相系统、LC-30AD 二元泵、SIL-30AC 自动进样器、SPD-M30A 检测器和CTO-20AC 柱温箱，以及8050 型三重四级杆定量质谱，配备ESI离子源和LabSolution 工作站（日本岛津公司）。Waters ACQUITY UPLC®BEH Shield RP18色谱柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，爱尔兰Waters 公司）；配备Waters ACQUITY UPLC®BEH Shield RP18VanGuardTM预柱（5 mm×2.1 mm，1.7 μm，爱尔兰Waters 公司）。PALLAS 3.3.2.6 ADME/Tox 预测软件（CompuDrug Chemistry Ltd.）。

2 方法

2.1 培养液和缓冲溶液的配制

完全DMEM 培养液-10、HBSS 平衡盐溶液、磷酸缓冲液（PBS）的配制参考文献方法[8]。

2.2 胶原包被Transwell 嵌套

用无菌水配制2 mg/mL 鼠尾胶原储备液，按10 μg/cm2配制鼠尾胶原包被工作液。

2.3 红参总皂苷（总三萜）提取物冻干粉的制备

取红参水煎液的正丁醇萃取物[6]少量，加适量水分散，经冷冻干燥后得红参总皂苷提取物冻干粉。

2.4 细胞培养和种板

从液氮中取出冻存的Caco-2细胞，以完全DMEM-10 培养复苏，待细胞稳定后，每4～5 天传代（细胞汇合率约80%），传代比例为1∶5。取鼠尾胶原包被工作液0.6 mL加入到6孔板的Transwell嵌套中，在超净台中放置2 h，使其干燥并部分包被。吸走嵌套中剩余的胶原溶液，立即用1 mL PBS 漂洗后，嵌套即可使用。细胞汇合率达到80%后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA 将细胞从培养瓶瓶壁上消化下来，用完全DMEM-10 终止消化并将细胞悬液的细胞数稀释到2.5×105个/mL。向6 孔板的底端（basolateral，BL）侧加入2.6 mL 完全DMEM-10培养液，向孔板的顶端（apical，AP）侧加入1.5 mL已充分混匀的细胞悬液。为避免培养初期死细胞堵塞膜表面，种板后的第1、3 天换液时先换AP 侧；第5 天以后细胞膜已基本形成。为避免暴露在空气中时间过长，换液时先换BL 侧。

2.5 Caco-2细胞单层完整性的考察

按标准操作规程[4]方法，用电阻仪测定6 孔Transwell 中的Caco-2细胞单层电阻值，以确定单层细胞的紧密性与完整性。本实验所用6 孔细胞单层的电阻值均大于800 Ω·cm2。

2.6 转运实验

2.6.1 红参总三萜提取物供试品的配制 本实验剂量选择根据红参中的特征性成分之一G-Rg5的含量来换算，依据单体化合物的Caco-2细胞单层评价给药剂量，设计G-Rg5给药剂量为50 μmol/L，实验前用DMSO 配制成5 mmol/L 储备液，实验时再以HBSS 缓冲液稀释100 倍；换算成红参总三萜提取物的给药剂量为3.472 mmol/L，即准确称取红参总皂苷提取物冻干粉133.3 mg 溶于500 μL 的DMSO中配制成储备液，作为测试液。

2.6.2 红参总三萜提取物的转运实验 在培养的第21 天取出6 孔Caco-2细胞单层Transwell 板，测定单层细胞电阻后，用37 ℃的HBSS 缓冲液洗涤AP侧和BL侧各2次，之后补加HBSS（AP侧加1500 μL，BL 侧加2600 μL），在恒温水浴摇床上温育（37 ℃、50 r/min），30 min 后取出，再次测定单层细胞的电阻值以确定其紧密性与完整性。然后吸走HBSS 溶液（保存、备用），根据实验设计，分别在单层细胞的两侧加入测试液和HBSS 溶液：转运实验时，AP侧向BL 侧转运（AP→BL），AP 侧加测试液1500 μL，BL 侧加空白HBSS 溶液2600 μL；外流实验时，BL侧向AP 侧转运（BL→AP），BL 侧加测试液2600 μL，AP 侧加空白HBSS 溶液1500 μL。加好后置于恒温水浴摇床温育（37 ℃、50 r/min）。90 min 后，取出Transwell 板，收集AP 侧和BL 侧的溶液。转运实验时，给药侧AP 取样500 μL，接收侧BL 取样2300 μL；外流实验时，给药侧BL 取样500 μL，接收侧AP 取样1300 μL。样品用封口膜封口、扎孔，然后置于-20 ℃冰箱冷冻保存，待测。

2.7 含量测定

2.7.1 样品处理 Caco-2细胞单层过膜样品经冷冻干燥后，BL 侧样品各加入300 μL 甲醇复溶，AP侧样品各加入200 μL 甲醇复溶，涡旋2 min，混匀后超声溶解10 min，再经15 000×g离心10 min，取上清，进样预设的LC-MS/MS 系统测定。

2.7.2 混合对照品的制备 精密称取上述42 个人参三萜皂苷对照品适量，用甲醇超声溶解制得除20(R)-G-Rg3（0.2 mg/mL）外，质量浓度均为1 mg/mL的各对照品储备液。精密吸取各对照品储备液适量，用甲醇稀释配制成含1 μg/mL 的20(S)-G-Rh1、G-Rg6、20(S)-NG-R2、20(S)-G-Rg2、G-Rb3、G-Ra2、20(R)-GRg3，500 ng/mL 的20(R)-G-Rh1、20(R)-G-Rg2、G-Rs2、G-Rs1、NG-R1、20-glu-G-Rf、竹节参皂苷IVa、20(S)-G-Rg3、G-Rg9、20(S)-PPT、20(R)-PPT、G-Rk3，4 μg/mL 的G-F4、G-Rs4、G-Rh4，2 μg/mL 20(S)-G-Rf、G-Re、G-Rk1，200 ng/mL 的20(R)-G-Rf、20(R)-NG-R2、20(S)-G-Rf2、20(R)-G-Rf2，250 ng/mL 的G-Ro 甲酯、G-Ra1、PG-F11、G-RT5、20(S)-G-Rs3、20(R)-G-Rs3，5 μg/mL 的G-Rd、G-Ro、G-Rb1、G-Rb2、G-Rc、G-Rg1、G-Rg5的混合对照品溶液。

2.7.3 色谱-质谱条件 液-质联用系统为岛津LCMS-8050 系列，色谱条件以及质谱参数与红参药动学的分析方法[9]完全一致，本实验中利用三重四极杆质谱测定42 个人参三萜成分设定的多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）离子对及一级四极杆预偏置电压（Q1 pre bias）、三级四极杆预偏置电压（Q3 pre bias）、碰撞能量（CE）等参数与红参药材含量测定的MRM 参数[10]一致，除了滞留时间（dwell time，DT）略有调整外，由于更换预柱，各化合物的保留时间（tR）亦略有变化。色谱-质谱参数见表1。

表1 各分析物的色谱-质谱参数Table 1 Chromatography-mass spectrometry parameters of each analyte

2.7.4 工作曲线的绘制 将混合对照品溶液用第3次洗涤细胞的HBSS 缓冲液倍比稀释成一系列浓度的混合对照品溶液，冷冻干燥后，甲醇复溶，涡旋2 min，混匀后超声溶解20 min，再经16 000×g离心10 min，取上清2 μL 在既定的LC-MS 条件[10]下进样分析。以对照品的质量浓度为横坐标（x），峰面积积分值为纵坐标（y），得到各对照品的线性回归方程（表2）。

表2 各分析物的标准曲线、r2 和线性范围Table 2 Calibration curve,coefficient and linear range of each analyt e

2.7.5 精密度、准确度、回收率 用HBSS 缓冲溶液将各对照品配制成低、中、高3 个浓度的混标溶液，冻干后甲醇复溶，漩涡2 min，混匀后超声溶解10 min，在15 000×g条件下离心10 min，取上清液进样LC-MS 系统检测。1 d 内连续测定3 次，根据各分析物峰面积计算日内精密度和准确度；1周内连续测定3 d，根据各化合物峰面积计算日间精密度和准确度（表3）。取0.5 mL 空白HBSS 溶液，精密加入适量高、中、低3 个浓度的混合对照品溶液（n＝6），分别用上述方法处理，进行检测，记录峰面积为A1；另取等量的高、中、低3 个浓度的混合对照品溶液（n＝6），补足相同体积的甲醇，直接进样检测，记录峰面积为A2，计算回收率（回收率＝A1/A2）。见表3。

表3 各分析物的日内和日间精密度、准确度以及回收率(n =6)Table 3 Intra-and inter-day precision,accuracy and recovery for 42 analytes(n =6)

续表3

续表3

续表3

2.7.6 质控样品制备 按照“2.7.4”项下方法制备得到系列浓度（7 个质量浓度）的混合对照品溶液，取2、5、7 标准曲线浓度点平行制备6 份样品，即为低、中、高浓度的质控样品。

2.7.7 稳定性 常温稳定性：将高、中、低3 个浓度的质控样品室温密封放置 24 h，测定其浓度；冻融循环稳定性：将高、中、低3 个浓度的质控样品经反复3 次-20 ℃冰冻-室温溶解后，测定其浓度；长期稳定性：将高、中、低3 个浓度的质控样品置于-20 ℃下1 个月，测定其浓度。稳定性考察结果表明，高、中、低质控样品的常温稳定性（RSD 值为0.86%～1.68%）、冻融循环稳定性（RSD 值为4.11%～1.93%）及长期稳定性（RSD 值为1.22%～3.98%）满足生物样品分析的相关要求。

2.8 表观渗透系数（Papp）计算和数据处理

受试分析物在Caco-2细胞单层模型中的Papp值按公式计算。每数据点为平行3 孔的平均值，用±s表示。

Papp＝dQ/dt×1/A×1/C0Q为累积转运量，代表分析物在接收室出现的总量（µmol/L）；dQ/dt表示速率（µmol/L·s）；C0为分析物在给药室的初始浓度（µmol/L·cm）；A为聚碳酯膜的表面积（cm2）

3 结果

3.1 MRM 色谱图

42 个人参三萜混合对照品的MRM 叠加色谱图、Caco-2 单层过膜前红参总人参三萜提取物的MRM离子对色谱图以及红参总人参三萜过膜后AP侧和BL 侧的MRM 叠加色谱图分别见图2-A～D，如图2所示，每个MRM 通道上的同分异构体都能达到满意的分离度。

图2 红参提取物过膜前后及其代表性的42 个三萜类化合物的MRM 色谱图Fig.2 Typical MRM chromatograms for Ginseng Radix et Rhizoma Rubra extracts before and after membrane crossing and 42 representative triterpenes of Ginseng Radix et Rhizoma Rubra extracts

3.2 红参总三萜提取物转运实验结果

红参中42 个人参三萜类化合物转运和外流的Papp值和PappAP→BL/PappBL→AP值见表4。从表4 结果可见，红参中绝大多数人参三萜的Papp值在8×10-7～9×10-6cm/s，预测它们经肠道吸收程度为中等或不良。从总体趋势可以看出，人参皂苷苷元PPT最容易被吸收，然后是单糖苷，诸如G-Rb1、G-Rc的四糖苷和G-Ra1、G-Ra2的五糖苷等则很难被吸收。

表4 红参提取物中42 个人参三萜类成分在Caco-2细胞单层模型的转运和外流的Papp 值(±s,n=3)Table 4 Papp Values of transport and efflux of 42 triterpenes in Ginseng Radix et Rhizoma Rubra extract by Caco-2 cell monolayer model(±s,n=3)

表4 红参提取物中42 个人参三萜类成分在Caco-2细胞单层模型的转运和外流的Papp 值(±s,n=3)Table 4 Papp Values of transport and efflux of 42 triterpenes in Ginseng Radix et Rhizoma Rubra extract by Caco-2 cell monolayer model(±s,n=3)

人参三萜 Papp AP→BL/(cm·s-1)Papp BL→AP/(cm·s-1)PappAP→BL/PappBL→AP 人参三萜 Papp AP→BL/(cm·s-1)Papp BL→AP/(cm·s-1)PappAP→BL/PappBL→AP G-Ra1（1.01±0.15）×10-7（0.98±0.12）×10-7 0.97 20(S)-G-Rh1（1.65±0.19）×10-6（1.92±0.23）×10-61.17 G-Ra2（1.06±0.13）×10-7（0.90±0.08）×10-7 0.85 20(R)-G-Rh1（2.03±0.29）×10-6（2.40±0.34）×10-61.18 G-Rb1（2.06±0.32）×10-7（1.81±0.19）×10-7 0.88 G-Rh4（5.18±0.54）×10-6（4.48±0.47）×10-60.87 G-Rb2（2.70±0.34）×10-7（2.54±0.24）×10-7 0.94 G-Rk1（4.03±0.26）×10-7（3.71±0.15）×10-70.92 G-Rb3（2.53±0.12）×10-7（2.68±0.13）×10-7 1.06 G-Rk3（5.68±0.60）×10-6（5.34±0.57）×10-60.94 G-Rc（2.43±0.11）×10-7（2.11±0.29）×10-7 0.87 G-Rs1（2.63±0.17）×10-7（2.36±0.16）×10-70.90 G-Rd（3.41±0.53）×10-7（2.86±0.29）×10-7 0.84 G-Rs2（2.59±0.45）×10-7（2.31±0.42）×10-70.89 G-Re（4.16±0.44）×10-7（5.19±0.58）×10-7 1.25 20(S)-G-Rs3（2.98±0.25）×10-7（2.79±0.21）×10-70.94 20(S)-G-Rf（4.78±0.39）×10-7（6.14±0.52）×10-7 1.29 20(R)-G-Rs3（2.40±0.14）×10-7（2.83±0.13）×10-71.18 20(R)-G-Rf（4.36±0.71）×10-7（5.84±0.69）×10-7 1.34 G-Rs4（1.16±0.10）×10-7（1.28±0.09）×10-71.10 20-glu-G-Rf（4.48±0.34）×10-7（4.75±0.75）×10-7 1.06 G-F4（6.03±0.47）×10-7（5.61±0.63）×10-70.93 20(S)-G-Rf2（4.94±0.65）×10-7（6.72±0.48）×10-7 1.36 NG-R1（3.88±0.14）×10-7（5.27±0.47）×10-71.36 20(R)-G-Rf2（5.31±0.29）×10-7（7.60±0.53）×10-7 1.43 20(S)-NG-R2（5.10±0.41）×10-7（6.45±0.54）×10-71.26 G-Rg1（5.22±0.32）×10-7（7.12±0.87）×10-7 1.36 20(R)-NG-R2（5.06±0.34）×10-7（5.78±0.46）×10-71.14 20(S)-G-Rg2（4.23±0.29）×10-7（5.11±0.31）×10-7 1.21 20(S)-PPT（8.04±0.69）×10-6（9.81±0.52）×10-61.22 20(R)-G-Rg2（6.11±0.83）×10-7（7.43±0.75）×10-7 1.22 20(R)-PPT（9.10±0.43）×10-6（1.06±0.05）×10-51.17 20(S)-G-Rg3（4.08±0.27）×10-7（3.63±0.16）×10-7 0.89 PG-F11（4.12±0.25）×10-7（7.09±0.49）×10-71.72 20(R)-G-Rg3（1.35±0.11）×10-7（1.66±0.08）×10-7 1.23 PG-RT5（1.16±0.18）×10-6（1.49±0.23）×10-61.28 G-Rg5（3.84±0.21）×10-7（4.42±0.18）×10-7 1.15 CS-IVa（3.57±0.20）×10-7（3.09±0.48）×10-70.87 G-Rg6（5.28±0.35）×10-7（4.70±0.41）×10-7 0.89 G-Ro（3.17±0.41）×10-7（2.62±0.35）×10-70.83 G-Rg9（4.34±0.12）×10-7（4.88±0.13）×10-7 1.13 G-Ro 甲酯（2.75±0.19）×10-7（2.12±0.17）×10-70.77

4 讨论

本实验对红参中人参三萜提取物进行了Caco-2细胞单层模型吸收转运评价研究，利用UFLC-MS/MS 高灵敏度等优势对红参过膜样品中的42 个人参三萜同时进行了测定。在吸收转运实验中，发现大多数人参三萜吸收程度为中等或不良，唯有2 个人参三萜皂苷元20(S)-PPT 和20(R)-PPT吸收程度良好（Papp值接近1×10-5cm/s）；此外，发现人参皂苷20(S)-G-Rh1、20(R)-G-Rh1、G-Rk3、G-Rh4、PG-RT5这5 个单糖苷的Papp值均在1×10-6cm/s 数量级，提示它们吸收程度为中等[11]。G-Rk3、G-Rh4的吸收强弱程度是G-Rh1的2～3 倍，前者化学结构仅是C17侧链比G-Rh1多了1 个双键。随着人参三萜皂苷糖取代基数目的增多，其Papp值越来越小，提示多糖苷的人参三萜皂苷在体内很难被吸收。在所有考察的 42 个人参三萜中，二糖苷20(R)-G-Rg3的Papp值相对较小，推测可能与其溶解度有关，20(R)-G-Rg3在甲醇中微溶，在水中几乎不溶，虽然其在红参水煎液中含量不低，但在过膜实验中，并不能完全以分子状态透过膜。在Caco-2细胞单层过膜吸收评价实验中，所考察的42 个人参三萜还包括了8 对R、S异构体，结果显示R/S异构体的吸收情况并没有显著性差异。以上结果相对于文献报道的单体人参皂苷给药量大多一致[12-18]，存在少数的波动，推测红参总三萜提取物中化合物之间可能存在着相互作用。实际上，口服人参皂苷会经肠内细菌转化为少糖基的人参皂苷[19]（即所谓的稀有人参皂苷）吸收进入体内发挥生物学作用[20]，由此推测人参三萜皂苷是前药（pro-drug）。本实验结果为确定红参的有效成分[21-22]提供了肠吸收方面的科学依据。结果提示，人参如果配伍能够促进肠内细菌活跃、分泌大量能够水解人参皂苷的水解酶的中药，使多糖基人参皂苷水解为少糖基皂苷或苷元而吸收进入体循环，更有益于发挥人参三萜的生物学活性[3,23]。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突