血清微小RNA-206和Clara细胞蛋白16表达水平与支气管哮喘患儿糖皮质激素疗效的相关性

崔丽，陈哲，张伟立，卢芳，朱永杰

(1.河南省第三人民医院，河南郑州 450000； 2.解放军总医院第八医学中心，北京 100000； 3.郑州儿童医院，河南郑州 450053)

支气管哮喘是儿童常见的气道非特异性慢性炎症性疾病，以气道高反应性或气道炎症为主要特征，多伴有广泛且多变的可逆性气流受限[1]。全球哮喘防治创议将糖皮质激素作为哮喘治疗首选药物，但吸入性糖皮质激素用于儿童哮喘的治疗效果具有明显个体差异[2-3]。有研究显示，为儿童哮喘经糖皮质激素治疗找出反应性相关基因可有效指导哮喘个体化治疗的开展[4]。目前有研究表明，微小RNA调控的基因与诱导哮喘发病的辅助性T细胞有关，其中微小RNA-206(miR-206)基因位点与白细胞介素(IL)-17a、IL-17b毗邻[5]。因IL-17参与多种炎性反应，与哮喘发生发展密切相关，故推测miR-206可能与糖皮质激素治疗哮喘的疗效有关。其他诸如Clara细胞蛋白16(CC16)，因具有极强的免疫抑制与抗炎活性，主要经支气管黏膜上细胞合成分泌，参与肺部炎性反应生理、病理过程[6],推测CC16与哮喘也有一定相关性。CC16表达水平可能影响哮喘糖皮质激素疗效，但是否介导儿童支气管哮喘的糖皮质激素疗效尚未明确，国内外直接相关的研究尚不多见。本研究主要探讨支气管哮喘患儿糖皮质激素治疗前后血清miR-206和CC16表达水平，旨在分析血清miR-206和CC16表达水平与药物疗效的相关性，以指导儿童支气管哮喘糖皮质激素的个性化治疗。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取河南省第三人民医院2017年11月至2019年11月收治的98例支气管哮喘患儿为支气管哮喘组，另选取同期常规体检健康儿童90例为健康对照组。其中，支气管哮喘组男51例，女47例；年龄4～14(7.48±1.04)岁；体质量18～55(30.21±4.42)kg；54例为学龄期儿童，44例为学龄前儿童。健康对照组男47例，女43例；年龄4～14(7.52±1.05)岁；体质量19～54(30.31±4.24)kg；50例为学龄期儿童，40例为学龄前儿童。支气管哮喘组患儿与健康对照组儿童性别、年龄、体质量等一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入标准和排除标准

本研究方案经医院伦理委员会批准同意。纳入标准：(1)符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》[7]中支气管哮喘相关诊断标准，且病情分级为轻中度；(2)急性发作期；(3)使用糖皮质激素治疗；(4)就诊前1个月内未使用其他药物或糖皮质激素全身用药治疗；(5)患儿家属对本研究知情并签署知情同意书。排除标准：(1)合并严重感染或其他严重疾病；(2)过敏性鼻炎；(3)合并荨麻疹；(4)合并其他心、肝、肾等重要脏器功能不全。脱落与剔除标准：(1)治疗期间发生严重并发症；(2)治疗中途主动退出；(3)治疗结束后失访。同期自愿加入本研究且经常规体检证实身体健康的儿童为健康对照组。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法 本研究纳入患儿均为轻中度哮喘，参照指南并结合患儿病情给予合理干预，首先进行防治教育、环境控制等非药物干预，在此基础上根据患儿病情给予速效β2受体激动剂缓解急性期症状。早期可使用大剂量吸入性糖皮质激素，有利于哮喘急性发作的控制，可为患儿选择吸入布地奈德悬液，每次1 mg，或选择丙酸倍氯米松混悬液，每次0.8 mg，3～4次/天。

1.3.2 疗效评价 持续治疗3个月后，参照《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》[7]中儿童哮喘症状控制水平分级评价治疗效果，并根据年龄进行评价，分别为<6岁患儿、≥6岁患儿。<6岁患儿评估项目主要包括：(1)持续至少数分钟，日间症状每周超过1次；(2)夜间因哮喘咳嗽或憋醒后，使用应急缓解药物次数每周超过1次；(3)因哮喘出现活动受限(步行或玩耍时易疲劳，较其他儿童玩耍/跑步减少等)。若患儿无上述症状，提示症状控制良好，记为显效；若存在其中1～2项症状，提示症状部分控制，记为有效；若存在3项及以上症状，提示症状未控制，记为无效。≥6岁患儿评估项目主要包括：(1)日间症状出现每周至少2次；(2)夜间因咳嗽或憋醒后，使用应急药物缓解每周至少2次；(3)因哮喘限制日常活动。若患儿无上述症状，提示症状控制良好，记为显效；若存在其中1～2项症状，提示症状部分控制，记为有效；若存在3项及以上症状，提示症状未控制，记为无效。

1.3.3 血清miR-206和CC16表达水平检测 健康对照组儿童体检当天抽取外周血检测，支气管哮喘组分别于入院当天、疗效评价当天检测血清miR-206和CC16表达水平。(1)血清miR-206检测：分别在各检测时间点抽取受检者空腹状态下外周肘静脉血5 mL，加入肝素抗凝，使用行知生物科技有限公司提供的分离液分离并提取外周血单个核细胞，将细胞调整为2×106/L，并接种在24孔细胞培养板上，加入适量的植物血凝素，放置在5% CO2、37 ℃培养箱内培养72 h，2 000 r/min离心10 min，取上清液待检。使用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法测定外周血单个核细胞中的miR-206水平。使用行知生物科技有限公司提供的仪器及配套将制得的外周血单个核细胞样本内总RNA逆转录，逆转录为cDNA，内参为U6，计算其相对表达量，检测中所用引物购自行知生物科技有限公司。(2)CC16水平检测：分别于各检测时间点采集受检者空腹状态下外周肘静脉血5 mL，使用美国States Biological公司提供的酶标仪及相关试剂盒，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验，严格参照说明书检测血清CC16水平。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 支气管哮喘组患儿糖皮质激素治疗效果

治疗后，支气管哮喘组显效、有效、无效例数分别为40例(40.82%)、39例(39.80%)及19例(19.39%)。

2.2 两组儿童首次检验miR-206、CC16水平比较

支气管哮喘组患儿血清miR-206和CC16表达水平均低于健康对照组儿童(P<0.05)，见表1。

表1 两组儿童首次检验miR-206、CC16水平比较

2.3 不同糖皮质激素治疗效果的患儿血清学指标水平比较

显效组患儿血清miR-206和CC16表达水平最高，其次为有效组、无效组(P<0.05)，见表2。

表2 不同糖皮质激素治疗效果的患儿miR-206、CC16水平比较

2.4 miR-206、CC16表达水平对糖皮质激素疗效影响的线性回归分析

miR-206、CC16表达水平作为自变量，糖皮质激素治疗无效作为因变量，通过线性回归分析得到回归方程：Y=1.895-1.131X1-0.046X2，结果显示血清miR-206和CC16低表达可能是儿童哮喘糖皮质激素疗效的影响因素(P<0.05)，见表3。

表3 各血清学指标对糖皮质激素疗效影响的线性回归分析

2.5 血清miR-206与CC16表达水平的相关性分析

双变量Pearson直线相关性检验结果显示，支气管哮喘患儿血清miR-206与CC16表达水平呈正相关(r=0.483，P<0.01)，相关性散点图见图1。

3 讨论

支气管哮喘治疗药物包括吸入性糖皮质激素、支气管扩张剂、抗胆碱能药物与抗白三烯类药物，此外，一些新型免疫治疗药物被联合应用于重症病例治疗，在全部可用于哮喘治疗的药物中吸入性糖皮质激素被国内外指南推荐作为哮喘基础治疗药物[8-9]。吸入性糖皮质激素治疗可作用于支气管哮喘各发病环节，抑制气道炎症，具有显著疗效，被推荐作为儿童支气管哮喘优先用药[10]。本研究未对所有患儿进行药物对照研究，98例支气管哮喘患儿经个体化糖皮质激素治疗后，79例患儿疗效评价为有效，可见糖皮质激素应用的价值。

图1 血清miR-206与CC16表达水平相关性散点图

随着临床对支气管哮喘个体化治疗认识的不断深入，糖皮质激素应用效果也被越来越多的学者质疑，多数研究认为糖皮质激素在儿童支气管哮喘中的应用效果存在的异质性可能受病情、病程等因素影响，但这一说法尚未得到证实，也有研究显示药物存在的这种疗效差异可能与机体部分基因缺失或免疫因素相关[11-12]。明确相关药物治疗效果对不同个体存在的差异有利于哮喘个体化治疗方案的制定与实施，在一定程度上也能提高治疗效果，改善哮喘患儿预后。微小RNA是非编码单股RNA，通过结合Argonaute家族蛋白参加诱惑性RNA的形成，从而诱导沉默复合体-沉默目标RNA，进而调节对应细胞因子的表达，参与机体多种疾病的病理生理过程[13-14]。有研究表明，微小RNA参与淋巴细胞终末分化进程[15]。作为一种主要的微小RNA，miR-206被认为参与骨肉瘤细胞的发生发展，且可能与体内各激素分泌有关[16]。徐庆雷等[17]发现，哮喘发作期患儿外周血单核细胞中miR-206水平低于缓解期患儿与健康儿童，提示其表达水平下降与哮喘发生发展密切相关。本研究结果显示，支气管哮喘组患儿miR-206水平低于健康对照组，与徐庆雷等[17]研究结果一致。进一步比较不同糖皮质激素治疗效果的患儿miR-206水平发现，治疗效果越好的患儿血清miR-206水平越高，推测miR-206表达缺失可能是导致糖皮质激素治疗效果不佳的主要原因，该推测也在进一步的线性回归分析结果中得以证实。

CC16蛋白是Clara细胞主要的分泌物，目前已被证实该蛋白在肺内有诸多关键性的生理功能，主要包括抗炎作用、抗纤维化作用及抑制肿瘤作用等[18]。此外，有研究表明，急性肺损伤患者肺水肿液与血浆内CC16蛋白含量下降也可作为肺上皮损伤标志，可将其作为急性肺损伤肺上皮生物标志物[19-20]。但CC16蛋白是否与支气管哮喘患儿疾病及治疗等有关目前尚不明确。本研究结果显示，支气管哮喘组血清CC16水平低于健康对照组，且支气管哮喘治疗显效组、有效组疗效优于无效组，进一步线性回归分析结果显示，血清CC16蛋白水平表达降低是哮喘患儿糖皮质激素疗效的影响因素。本研究已证实血清miR-206与CC16表达水平对支气管哮喘患儿糖皮质激素疗效的影响，但二者间是否存在相关性报道较少。本研究结果显示，血清miR-206与CC16表达水平在支气管哮喘患儿中呈正相关，推测血清miR-206与CC16表达可能存在相互作用，共同对支气管哮喘患儿糖皮质激素疗效产生影响。因本研究未能得到其他有力的循证学依据作为理论支持，且纳入样本较少，研究时间较短，存在一定局限，结果真实性与可靠性仍需大量的前瞻性、大样本、多中心研究加以验证。

综上所述，血清miR-206和CC16表达水平低表达可能是支气管哮喘患儿糖皮质激素治疗效果的影响因素，临床可考虑在入院时检测支气管哮喘患儿血清miR-206和CC16表达水平，高度重视低表达患儿，并进行合理干预，以提高糖皮质激素治疗效果。