氟化钠促进节杆菌发酵合成环磷酸腺苷的生理机制

顾阳 谭海 员林娜 孙海彦 常景玲 李志刚

（1.河南科技学院生命科技学院 现代生物育种河南省协同创新中心，新乡 453003；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南省热带微生物资源重点实验室，海口 571101）

环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）作为生物体的第二信使，对新陈代谢具有重要的调节作用［1-2］，作为药物具有提高机体免疫力、促进血液循环、改善心血管功能、预防过敏性疾病等功能，作为饲料添加剂在畜禽产品的生产中应用广泛［3-4］。

利用微生物发酵生产cAMP时，存在严重的“碳溢流”现象并伴随着副产物腺苷（AR）的大量积累。“碳溢流”即糖酵解途径与三羧酸循环之间碳流不匹配，导致大量有机酸（乙酸和乳酸）产生；不仅大大降低cAMP对碳源的得率，导致碳源的严重浪费，还会引起培养环境的酸化，不利于菌体的生长代谢和产物合成［5-6］。副产物AR和cAMP均以AMP为原料合成，存在竞争关系，AR积累会影响产物产量和糖苷转化率的提高。另外，cAMP和AR性质相近，AR的积累大大增加了产物分离纯化的难度和成本。因此，合理调节碳代谢，减少有机酸和AR的积累是提高cAMP产量与得率的有效手段。

目前，关于调节代谢流改善cAMP发酵性能的研究主要集中在抑制糖酵解途径、强化能量代谢以及工艺条件优化等方面［7-8］。本实验室前期研究中，通过外源添加柠檬酸钠、丙酮酸钠以及低聚磷酸盐等辅助能量物质，促进前体ATP的合成，改变代谢流分配，提高了cAMP产量和生产效率［9-10］。Chen等［11］利用不同抑制剂对糖酵解途径进行调节，发现氟化钠能够缓解“碳溢流”现象，有利于cAMP的合成。Song等［12］通过离子束注入法对节杆菌进行诱变处理，成功筛选到cAMP高产菌株，并利用糖酵解抑制剂大幅提高了cAMP产量。

氟化钠是一种常见的糖酵解抑制剂，对丙酮酸激酶和烯醇化酶具有较强的抑制作用［13-14］。cAMP发酵过程中，利用氟化钠促进产物合成的方法已经使用多年［11］。Niu等［15］通过13C 葡萄糖标记法进行代谢通量分析发现，氟化钠提高了HMP途径的通量，促进了cAMP的生物合成。但以上研究只关注了氟化钠对糖酵解和磷酸戊糖途径中代谢通量的影响，忽视了氟化钠对能量代谢及副产物AR合成的影响。在发酵过程中，cAMP由ATP直接环化形成，而ATP磷酸化所需能量主要由NADH氧化交出电子并经电子呼吸链传递提供，强化能量代谢有利于产物合成［9］，另外，AR是由AMP在5′-核苷酸酶催化下脱磷酸生成，AR与产物合成均以AMP为底物，抑制5′-核苷酸酶活性，减少副产物AR积累，可以有效提高糖苷转化和产物合成。本研究针对cAMP发酵合成的特点，从发酵动力学、各相关途径碳通量和能量代谢等角度探讨氟化钠促进产物合成的生理机制，旨为进一步提高产物发酵性能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本实验室保藏的节杆菌Arthrobacter sp.CCTCC 2013431，培养基配制方法参见文献［9］。

1.1.2 仪器 SW-CJ-2FD双人垂直净化工作台 苏净集团安泰公司制造；LMQ.C-100E高压灭菌锅 山东新华医疗器械股份有限公司；ZWF-2112摇床 上海智城分析仪器制造有限公司；BIOTECH-7BG机械搅拌式发酵罐 上海保兴生物设备有限公司；UV-2800紫外分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；液相色谱仪岛津LC-2030C 日本岛津仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养方法 摇瓶培养和发酵罐培养操作详见前期研究［9］。摇瓶发酵培养基中氟化钠添加量分别0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 g/L，每个条件做3个平行试验。

1.2.2 分析方法 菌体干重（DCW）和葡萄糖测定方法参见文献［7］。腺苷酸环化酶与琥珀腺苷酸合成酶活性测定方法参见文献［16］。5′-核苷酸酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、丙酮酸激酶及己糖激酶活性采用试剂盒（Solarbio）进行测定，比酶活以U/mg蛋白表示。NADH和NAD+浓度采用试剂盒（Solarbio）进行测定。

乙酸和乳酸采用高效液相色谱法测定［17-18］。胞内代谢物柠檬酸、丙酮酸和草酰乙酸含量采用高效液相色谱法测定［19］。cAMP、腺苷、次黄嘌呤以及胞内ATP、AMP浓度测定均使用高效液相色谱测定［9，12］。天冬氨酸和谷氨酸采用Waters公司开发的AccQ-Tag法测定，操作方法和步骤按照说明书进行。

2 结果

2.1 不同氟化钠添加量对cAMP发酵合成的影响

有研究表明，氟化钠可以有效降低糖酵解途径的碳通量［11］，促进cAMP的发酵合成。在250 mL锥形瓶中进行了添加不同浓度氟化钠的发酵试验，结果表明，随着添加量的逐渐增加菌体浓度（DCW）和葡萄糖消耗量呈下降趋势，而cAMP产量和转化率则随添加量增加呈现先升后降的趋势，氟化钠添加量为0.2 g/L时，cAMP产量和转化率均达到最高值3.16 g/L和0.103 g/g，比对照（未添加氟化钠）分别提高了35.6%和41.1%。表明添加氟化钠虽然一定程度上抑制了菌体生长，却能有效提高cAMP产量和得率。另外，氟化钠添加量超过0.25 g/L时，菌体浓度、葡萄糖消耗，以及cAMP产量和转化率均快速下降，表明高浓度的氟化钠强烈抑制菌体生长和正常代谢，导致发酵产物的急剧下降（表1）。

2.2 7 L发酵罐中添加氟化钠提高cAMP发酵整体性能

在7 L发酵罐中进行了添加0.2 g/L氟化钠的发酵实验，结果如图1所示。添加与未添加氟化钠两批次中，次黄嘌呤浓度在发酵30 h后降至0.2 g/L以下，不再变化（图1-B），表明发酵30 h后次黄嘌呤消耗殆尽，没有嘌呤类物质存在条件下菌体开始通过从头合成途径生产cAMP（从头合成发酵模式）。发酵72 h，添加氟化钠批次的cAMP产量达到3.36 g/L，与对照批次相比，提高了25.8%，由于葡萄糖消耗量在两批次中相差很小，cAMP得率也得到等幅度的提高。与对照批次相比，腺苷、乙酸和乳酸等副产物的积累量均显著下降，分别降低了61.1%、54.8%和55.4%。腺苷与cAMP的合成都以AMP为原料，存在竞争关系，腺苷积累减少有利于cAMP产量和得率的提高；有机酸生成量下降不仅减少了碳源的浪费，而且使pH在发酵前期下降速度缓慢，后期回升加速，改善了培养环境（图1-D）。总之，通过从头合成发酵模式生产cAMP时，适量添加氟化钠可以有效降低副产物的积累，缓解“碳溢流”现象，促进cAMP的合成。

与从头合成途径相比，补救途径能够直接利用外源嘌呤类物质进行cAMP的合成，代谢途径缩短，能量消耗降低，产物合成效率高。在7 L发酵罐上进行了添加0.2 g/L氟化钠的cAMP补救合成模式发酵实验，发酵29 h向发酵液中添加1 g/L次黄嘌呤，使菌体继续通过补救途径合成产物。如图2-B所示，与对照相比，添加氟化钠批次中次黄嘌呤利用更快速，最终发酵液中残留浓度也明显低于对照；cAMP产量在68 h达到最大值4.35 g/L，比对照批次提高了27.9%，两批次中葡萄糖消耗量相当，cAMP得率也得到显著提高。此外，腺苷含量比对照批次的减少了64.1%，有机酸积累量也显著降低（数据未给出）。以上结果表明，利用补救合成模式发酵cAMP时，添加适量氟化钠能够促进次黄嘌呤的快速利用，减少副产物腺苷和有机酸的积累，使更多碳源用于产物合成，促进cAMP产量和转化率的提高。

图1 氟化钠对cAMP从头合成发酵模式整体性能的影响Fig.1 Effects of NaF on cAMP fermentation production by de novo synthesis fermentation mode

图2 氟化钠对cAMP补救合成发酵模式整体性能的影响Fig.2 Effects of NaF on cAMP fermentation production by salvage synthesis fermentation mode

2.3 氟化钠对cAMP合成途径中关键酶活性的影响

cAMP生物合成途径涉及磷酸戊糖途径、腺苷酸合成途径以及AMP磷酸化、ATP环化等过程，碳代谢流分配直接影响着产物的合成，而糖酵解途径和磷酸戊糖途径间的碳流分配尤为重要。己糖激酶（hexokinase，HK）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是糖酵解途径的限速酶，活性强弱反映了糖酵解途径的代谢强度。6-磷酸葡萄糖脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）和琥珀腺苷酸合成酶（sAMPase）分别是磷酸戊糖途径和腺苷酸合成途径的关键酶，分别反映了碳流在两条途径中分配情况。对添加与未添加氟化钠批次26、36、50和60 h样品的胞内HK、PK、G6PDH和sAMPase的活性进行测定，结果如图3所示。与对照批次相比，添加氟化钠批次的HK活性有很小幅度的下降，并不显著，而PK活性显著下降，在36 h下降幅度最大达到40.2%，同时，G6PDH和sAMPase的活性明显提高，最大涨幅分别达到100%和72.7%。表明氟化钠添加对菌体利用葡萄糖的影响不大，但糖酵解途径已经被显著抑制，更多的碳流分配到磷酸戊糖途径，进而通过腺苷酸合成途径转化为AMP，为产物合成提供原料。

图3 氟化钠对cAMP合成相关途径中关键酶活性的影响Fig.3 Effects of NaF on the activities of key enzymes presented in cAMP biosynthesis pathways

AMP一方面经磷酸化形成ATP，进而由腺苷酸环化酶（AC）催化合成cAMP，一方面在5′-核苷酸酶（5-NT）作用下脱去磷酸基形成腺苷，腺苷大量形成必然对cAMP的积累以及后续分离纯化过程产生不利影响。对添加与未添加氟化钠批次的AC和5-NT的活性进行测定，结果表明AC活性在氟化钠的作用下明显提高，而5-NT的活性却大幅下降（图4）。表明副产物腺苷的合成受到氟化钠的抑制，产物竞争AMP的压力减弱，同时AC活性提高为产物合成提供了有力条件。

2.4 氟化钠对胞内关键代谢物含量的影响

细胞内中间代谢物含量的变化一定程度上反映了代谢流分配情况。对糖酵解、三羧酸循环中的代谢物丙酮酸、草酰乙酸和柠檬酸，产物合成的前体氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）含量进行测定，结果如图5所示。与对照批次相比，添加氟化钠使丙酮酸含量明显减少，草酰乙酸和柠檬酸含量变化不显著，而天冬氨酸和谷氨酸含量有明显的增加。氟化钠显著的抑制了糖酵解途径，同时三羧酸循环代谢强度并没有明显的改变，考虑到乙酸和乳酸合成显著下降的现象（图1-C），猜想氟化钠使原用于合成乙酸和乳酸的碳流分配到磷酸戊糖途径，从而缓解了“碳溢流”现象，而进入三羧酸循环的碳流并未受到明显影响。另外，前体氨基酸含量增加也为产物的合成奠定了物质基础。

图4 氟化钠对腺苷酸环化酶和5′-核苷酸酶活性的影响Fig.4 Effects of NaF on the activities of AC and 5-NT

图5 氟化钠对胞内关键代谢物含量的影响Fig.5 Effects of NaF on main intracellular metabolites contents

2.5 氟化钠对cAMP生物合成过程中能量代谢的影响

cAMP由ATP在腺苷酸环化酶作用下直接环化合成，胞内高ATP含量和ATP/AMP有利于产物合成。AMP磷酸化合成ATP所需能量主要由电子呼吸链提供，而NADH是电子呼吸链的主要电子供体，因此，NADH/NAD+的提高可以促进ATP的生成，进而促进产物合成。对添加与未添加氟化钠批次的ATP/AMP和NADH/NAD+进行测定，结果表明添加氟化钠致使ATP/AMP和NADH/NAD+明显提高（图6），为产物合成提供有利条件。这可能是由于氟化钠抑制了糖酵解途径，缓解了“碳溢流”现象，使有机酸生成量大幅减少（图1-C），NADH的消耗随之下降（乙酸和乳酸生成需要NADH作为辅酶），最终导致NADH/NAD+和ATP/AMP得到明显提升。

3 讨论

cAMP微生物合成过程具有反应条件温和、环境友好等优势，受到越来越多的关注。目前，能够积累cAMP的微生物主要来源于微杆菌属（Microbacterium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、节杆菌属（Arthrobacter）及酵母菌属（Saccharomyces），其中节杆菌研究最多［20］。然而，cAMP发酵过程中存在严重的“碳溢流”现象，导致大量有机酸产生，不仅造成碳源的浪费，酸性条件还会影响细胞正常代谢和产物合成［5］。“碳溢流”是由于糖酵解途径和三羧酸循环之间碳流不匹配导致的，前者的代谢通量超过后者，过剩的碳流在消耗大量NADH的条件下，形成有机酸释放到胞外［21］。通过敲除关键酶基因和添加抑制剂弱化糖酵解途径的代谢强度，能够使代谢流重新分配，更多的分配到磷酸戊糖途径，“碳溢流”现象能够得到缓解［11，22］。

图6 添加氟化钠对细胞内能量代谢的影响Fig.6 Effects of NaF on NADH/NAD+ and ATP/AMP

由于缺少有效的基因改造手段，相关报道主要通过添加抑制剂的方式对cAMP生产菌株进行代谢调控［23］。有研究表明，氟化钠能够有效抑制丙酮酸激酶和烯醇化酶活性，进而降低糖酵解途径的代谢通量［13-14］。Chen等［11］使用氟化钠、碘乙酸、柠檬酸等多种抑制剂弱化糖酵解途径发现，氟化钠的效果最好，有效缓解“碳溢流”现象，cAMP产量得到显著提高。本研究中，通过向cAMP发酵液中添加氟化钠，丙酮酸激酶活性显著下降，而6-磷酸葡萄糖脱氢酶、琥珀腺苷酸合成酶及腺苷酸环化酶等活性得到明显提升，同时有机酸积累大幅下降，cAMP产量显著提高。表明氟化钠有效抑制糖酵解途径，缓解了“碳溢流”现象，使更多碳流分配到产物合成途径。另外，由于5′-核苷酸酶活性显著降低，产物合成的一条分支途径被抑制，副产物腺苷的积累显著下降，为提高cAMP产量和得率提供有利条件。

在微生物细胞内，cAMP以ATP为底物直接环化形成，ATP持续高效合成是促进产物合成的重要因素［22］。ATP合成不仅需要前体氨基酸（天冬氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸）和戊糖等原料，还需要磷酸化反应所需的能量［10，19］。前期研究中，通过外源添加柠檬酸钠、丙酮酸钠以及低聚磷酸盐等辅助能量物质，促进前体ATP的合成，提高了cAMP产量和生产效率［9-10］。本研究中由于氟化钠的作用，胞内前体氨基酸含量明显提高，为产物合成奠定了物质基础；同时由于有机酸合成量降低，NADH消耗量大幅减少，使NADH/NAD+得到明显提高，为产物合成奠定了能量基础。氟化钠促进cAMP生物合成机制的阐述，为高产菌株筛选和高产策略开发奠定了理论基础。在后续工作中，将着重于cAMP生物合成途径代谢调节机制的研究以及有效基因编辑工具的开发，进一步阐明cAMP合成调控机制，提高产物产量和转化率。

4 结论

通过添加0.2 g/L氟化钠，两种发酵模式（从头合成模式和补救合成模式）的cAMP产量分别达到3.36 g/L和4.35 g/L，与对应未添加氟化钠批次相比，分别提高了25.8%和27.9%，腺苷和有机酸合成量显著降低，发酵性能得到明显改善。对cAMP合成途径关键酶活性测定结果表明，氟化钠抑制了PK和5-NT活性，而G6PDH、sAMPase和AC的活性得到明显提高，表明糖酵解途径和5-NT受到抑制，有机酸和腺苷合成受阻，更多碳流分配到产物合成途径。通过氟化钠的添加，ATP/AMP和NADH/NAD+均得到明显提高，是由于有机酸合成量大幅减少，NADH的消耗随之下降，促进了ATP的合成，为产物合成提供有利条件。