ctDNA对肝细胞肝癌患者根治性肝切除术后短期复发的预测价值

陈延华，邓凯文

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）大约占原发性肝癌的85%～90%，具有极高的复发率、转移率，患者整体预后较差［1］。根治性肝切除术（pancreatico－duodenectomy，PD）是HCC治疗的首选方法，但术后复发率高，尤其是2年内的早期复发对治疗效果造成严重影响，可直接缩短患者术后长期生存时间［2，3］。血浆循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是一种携带肿瘤特异性基因组改变的肿瘤标志物，被广泛应用于多种肿瘤诊断和预后生物标志物的研究［4］。该研究通过分析ctDNA对HCC患者根治性肝切除术后短期复发的预测价值，旨在为术后肝癌患者筛查、诊断、治疗提供指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性分析2017年1月—2019年1月行根治性肝切除术的208例HCC患者的临床资料，纳入标准：（1）接受根治性肝切除术治疗；（2）术前未发现远处转移；（3）心、肺、肾功能良好，能够耐受手术；（4）术后病理确诊为HCC；（5）肉眼所见肿瘤被完整切除，且切缘无残余癌。排除标准：（1）无法耐受手术；（2）手术前进行其他抗癌治疗；（3）围手术期死亡。208例HCC患者中，男162例，女46例；年龄20～78岁，平均（53.91±8.24）岁。选取正常人群85例作为对照，男59例，女26例；年龄22～79岁，平均（54.12±8.37）岁。2组性别、年龄等资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法术后抽取患者肘静脉血10 ml用以检测ctDNA表达，具体步骤如下：（1）离心分离血浆备用；（2）采用DNA抽提试剂盒提取ctDNA，操作严格按说明书进行；（3）使用试剂盒将打断后的DNA进行文库构建，PCR扩增文库；（4）测序获取全基因组长度；（5）Blast比对，进行CNVs分析，计算ctDNA含量，以健康人群ctDNA百分含量做参照，设定以ctDNA含量＜0.1%为阴性，ctDNA含量≥0.1%为阳性。

1.3 随访患者手术出院后采用门诊随访进行观察，随访截止至2019年2月或患者死亡，检查患者肝功能、CT明确患者肿瘤是否复发以及发生肝外转移，具体方案为：术后3个月，每月来院复查1次，术后6个月，每3个月来院复查1次，术后1年，每6个月复查1次。

1.4 观察指标（1）比较ctDNA在肝癌组和对照组中的表达差异，根据随访结果将肝癌组患者分为复发组（肝内复发、肝外转移）和非复发组，其中复发组患者复发时间≤6个月纳入短期复发组，复发时间＞6个月纳入非短期复发组；（2）比较不同组别肝癌组织中ctDNA阳性表达率的差异；（3）分析患者性别分布、年龄、肝功能Child分级、肿瘤直径、肿瘤数目、血清肝炎病毒标志物、门静脉癌栓、包膜完整、分化程度以及ctDNA表达与HCC患者根治性肝切除术后肿瘤短期复发的关系。

1.5 统计学分析应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计数资料以［n（%）］表示，行χ2检验；ctDNA表达及其与临床病理特征关系比较采用χ2检验，将所有可能的危险因素进行多因素Logistic回归分析；生存情况应用Kaplan－Meier生存分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 随访结果术后对208例HCC患者进行随访5～86个月，中位随访时间39个月，至随访终止，133例患者确诊为HCC复发转移（复发组），占63.94%，其中短期复发（短期复发组）占30.83%（41/133），非短期复发（非短期复发组）占69.17%（92/133），75例无复发（非复发组），占36.06%。短期复发组中肝外转移占36.59%（15/41），高于非短期复发组的15.12%（14/92），差异有统计学意义（χ2=7.595，P=0.006）。随访终止时死亡102例，死因与HCC复发转移相关占93.14%（95/102），与肝病相关占4.90%（5/102），其他因素占1.96%（2/102），短期复发组病死率为90.24%（37/41），高于非短期复发组的66.30%（61/92），差异有统计学意义（χ2=8.382，P=0.004）。

2.2 ctDNA在HCC中的表达情况肝癌组ctDNA阳性表达151例，占72.60%（151/208），对照组均不表达ctDNA，2组阳性表达率比较，差异有统计学意义（χ2=127.325，P＜0.001）。复发组阳性表达99例，占74.44%（99/133），非复发组阳性表达52例，占69.33%（52/75），2组比较差异无统计学意义（χ2=0.628，P=0.428）。短期复发组阳性表达率为87.80%（36/41），高于非短期复发组的68.48%（63/92），差异有统计学意义（χ2=5.567，P=0.018）。

2.3 HCC患者术后肿瘤短期复发与临床病理特征比较肿瘤直径＞5 cm、肿瘤数目多个、门静脉有癌栓、包膜不完整、低中分化以及ctDNA表达阳性患者术后肿瘤短期复发率明显升高（P＜0.05）。见表1。

表1 HCC患者根治性肝切除术后肿瘤短期复发与临床病理特征比较

续表1

2.4 影响HCC患者术后肿瘤短期复发的多因素Logistic回归分析以根治性肝切除术后肿瘤短期复发为因变量（1=复发，0=无复发），将单因素分析中可能的危险因素（肿瘤直径＞5 cm、肿瘤数目多个、门静脉有癌栓、包膜不完整、低中分化以及ctDNA表达阳性）全部纳入作为自变量，多因素Logistic回归分析结果显示，肿瘤直径＞5 cm、门静脉有癌栓、低中分化以及ctDNA表达阳性是影响根治性肝切除术后肿瘤短期复发的独立危险因素（P＜0.05）。见表2。

表2 影响HCC患者根治性肝切除术后肿瘤短期复发的多因素Logistic回归分析

2.5 ctDNA表达与术后短期复发HCC患者生存情况关系Kaplan－Meier生存分析结果显示，ctDNA阳性表达组短期复发HCC患者生存时间为3.71个月（95%CI：3.30，4.12），ctDNA阴性表达组短期复发HCC患者生存时间为5.64个月（95%CI：5.44，5.85），ctDNA阳性表达组短期复发HCC患者生存时间与ctDNA阴性表达组短期复发HCC患者比较，差异有统计学意义（Log－rankχ2=7.622，P=0.006）。见图1。

图1见封三。

图1 ctDNA表达与根治性肝切除术后短期复发HCC患者生存情况关系

3 讨论

HCC是全球癌症死亡的主要原因，多数患者确诊时已处于晚期肝纤维化和肝硬化状态，尽管根治性肝切除术可取得良好的治愈效果，但患者预后仍然较差，术后患者早期复发率较高，长期生存时间不尽满意［5－8］。因此、早期诊断、治疗、疗效预测以及改善患者预后，对延长患者长期生存时间、提高整体生活质量有重要意义。近年来研究发现，检测血液中ctDNA在肿瘤诊断、治疗以及预后评估等方面发挥重要作用［9］。利用ctDNA筛选基因突变具有较高的敏感性和特异性，ctDNA分析可准确判断肿瘤进展、预后以及辅助靶向治疗［10］。Olsson等［11］研究显示，ctDNA是原发性乳腺癌预后不良的预测因素，对ctDNA进行监测可以预测几个月到几年的临床转移，检测ctDNA在原发性乳腺癌中具有较好的应用前景。Chaudhuri等［12］报道指出，ctDNA是早期发现局限性肺癌术后残留病灶的生物标志物，能够可靠地鉴别复发的高危患者，有利于指导临床制定治疗策略。Xu等［13］报道认为，HCC肿瘤DNA与匹配的血浆ctDNA甲基化标志物高度相关，可有效预测患者预后和生存率预后。

该研究结果显示，短期复发患者占全部复发患者的30.83%，但90.24%患者在随访期内死亡，表明6个月作为短期复发时间可较早反映患者预后情况。该研究结果还显示，对照组患者均未检测出ctDNA表达，短期复发组ctDNA阳性表达率87.80%明显高于非短期复发组的68.48%，且HCC患者根治性肝切除术后肿瘤短期复发率与患者肿瘤直径、肿瘤数目、门静脉癌栓、包膜完整、分化程度以及ctDNA表达明显相关，表明ctDNA预测疾病复发具有较高的特异性、敏感性，可能与HCC患者根治性肝切除术后肿瘤短期复发有关。进一步多因素Logistic回归分析发现，患者肿瘤直径＞5 cm、门静脉有癌栓、低中分化以及ctDNA表达阳性是影响根治性肝切除术后肿瘤短期复发的独立危险因素，表明ctDNA表达阳性患者具有更高的肿瘤复发率，可作为预测HCC患者根治性肝切除术后肿瘤短期复发的重要指标。通过Kaplan-Meier生存分析结果显示，ctDNA阳性表达组短期复发HCC患者生存时间为3.71个月（95%CI：3.30，4.12），ctDNA阴性表达组短期复发HCC患者生存时间为5.64个月（95%CI：5.44，5.85），ctDNA阳性表达组短期复发HCC患者生存时间明显短于ctDNA阴性表达组短期复发HCC患者，进一步表明ctDNA表达阳性短期复发HCC患者生存预后更差，检测ctDNA表达可作为术后辅助治疗的依据。检测ctDNA表达可实时追踪肿瘤进展，有效识别患者体内微小残留病灶以及疾病休眠，因此，ctDNA可作为HCC患者根治性肝切除术后肿瘤短期复发的重要预测指标［14，15］。总之，ctDNA在HCC中具有良好的应用前景，检测术后患者ctDNA表达以及研究其与预后的关系，值得更多学者深入探究，ctDNA作为精准、无创的检测手段，或可在HCC各个临床阶段发挥作用。

综上所述，肝癌组织中ctDNA阳性表达率明显升高，ctDNA是预测HCC患者根治性肝切除术后肿瘤短期复发的独立危险因素，ctDNA阳性表达短期复发患者生存时间明显短于ctDNA阴性表达患者，根治性肝切除术后对ctDNA进行监测有助于早期鉴别高危患者，进而予以个性化治疗以延长患者生存时间，改善患者生活质量，提高治愈率。但该研究所收集样本例数受限，所得到的结论有待进行深入研究佐证。