腺病毒介导的shRNA下调GLP-1R表达对小鼠内皮祖细胞功能的影响及机制研究

黄小川，涂 强，帅青云，付 杰，谢华强，张 琰， 曹 政

糖尿病是重要的心血管病危险因素，糖尿病引起的血管病变已经成为严重危害我国人民健康的重大慢性疾病。研究证实，血管内皮损伤修复及血管新生能力障碍是糖尿病缺血性血管病变的关键环节和始动机制[1]。骨髓和外周血中存在内皮细胞的前体细胞内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是修复血管损伤的重要细胞生物学基础，在参与血管损伤修复和血管新生中起着重要作用[2]。胰高血糖素样肽-1是经肠道L细胞分泌的多肽类物质，其通过与胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R)结合促进胰岛素分泌从而发挥降糖作用[3]。近年来，GLP-1R激动剂在2型糖尿病治疗方面已获肯定，与传统降糖药物相比，除可以稳定降糖外，还具有减重、调脂、降压、护肾和降低心血管不良事件风险等益处[4-5]。然而，GLP-1R能否调控EPCs功能活性，促进损伤血管内皮的修复，目前尚不明确。本实验拟研究下调GLP-1R 表达对小鼠EPCs功能活性的影响，并初步探讨其可能机制，以期为EPCs介导的细胞疗法提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 8周龄雄性C57BL/6J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK-京-2016-0006)；小鼠淋巴细胞分离液(C-10831)及人纤维连接蛋白(F0895)购自美国Sigma公司；EGM-2培养基(C-22121)购自美国PromoCell公司；人重组血管内皮生长因子(100-20)购自美国PeproTech公司；携带靶向GLP-1R的shRNA并表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的重组腺病毒及携带无义序列shRNA并表达GFP的重组腺病毒均购自山东维真生物科技有限公司；逆转录PCR试剂盒(KR123)购自TIANGEN公司；RIPA裂解液(P0013C)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012S)及β-actin抗体(AF5001)均为碧云天公司生产；GLP-1R抗体(sc-390773)购自美国Santa Cruz公司；抗AKT抗体(YT0185)、抗磷酸化AKT 抗体(YP0006)、抗eNOS 抗体(YM3164)、抗磷酸化eNOS 抗体(YP1238)购自美国Immunoway公司；其他试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2 细胞处理 从8周龄健康的C57BL/6J小鼠中分离提取骨髓单个核细胞并诱导分化成EPCs，用培养5 d的EPCs进行转染。当细胞生长至50%～60%融合时，以感染复数(multiplicity of infection，MOI)为200进行腺病毒转染。确定所需病毒颗粒量，用不含血清及抗生素的EGM-2培养液稀释腺病毒后加入细胞培养瓶，分别于腺病毒转染12 h、24 h、48 h和72 h在倒置荧光显微镜下观察细胞的荧光表达，并计算转染效率。

1.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测GLP-1R的mRNA表达 腺病毒转染48 h后检测各组EPCs中GLP-1R mRNA表达。使用Trizol试剂提取细胞中总RNA，测定总RNA浓度，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录获得cDNA，并以cDNA为模板，扩增目的片段。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。GLP-1R正向引物5′-ACGGTGTCCCTCTCAGAGAC-3′，反向引物5′-ATCAAAGGTCCGGTTGCAGAA-3′；内参β-actin正向引物5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′，反向引物5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′。置于实时荧光定量PCR仪中进行扩增，采用2-ΔΔCT法计算GLP-1R mRNA的相对表达量。

1.4 细胞迁移能力检测 腺病毒转染48 h后将EPCs消化重悬，按照5×104个/孔接种于Boyden小室上室，置24孔板中，在下室中加入700 μL含或不含50 ng/mL血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的EGM-2培养基，然后将其置于37 ℃培养箱培养； 24 h后取出Boyden小室，小心弃去上层液体，用棉签小心擦掉小室滤膜孔上表面上未迁移的细胞； 将Boyden小室置于4%多聚甲醛溶液中，固定10 min； 滴加适量4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核，荧光显微镜下拍照，选择5个不同视野计数。

1.5 细胞黏附能力检测 腺病毒转染48 h后将EPCs消化重悬，按照3×105个/孔接种于12孔板，培养5 h后小心弃去上层培养基，加入4%多聚甲醛溶液中固定10 min； 滴加适量0.1%结晶紫染液染色，经磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗2次后于倒置显微镜下拍照，选择5个不同视野计数。

1.6 细胞衰老检测 腺病毒细胞转染48 h后小心弃去上层培养基，加入4%多聚甲醛溶液中固定10 min，用PBS溶液小心将细胞清洗2次，之后按照碧云天公司生产的β-半乳糖苷酶染色试剂盒添加染色液，放置37 ℃不含二氧化碳的温箱中孵育24 h之后于普通显微镜下观察拍照，被染成蓝色的即为衰老细胞，选择5个不同视野计数。

1.7 EPCs中GLP-1R，p-AKT/AKT和p-eNOS/eNOS蛋白表达量检测 采用免疫印迹法(Western Blot)。腺病毒转染48 h后采用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，细胞充分裂解后于4 ℃离心(12 000 r/min)15 min，并取上清采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，并转印GLP-1R、p-AKT/AKT和p-eNOS/eNOS蛋白至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，用相应的特异性一抗4 ℃孵育过夜，再经洗膜，然后孵育相应二抗室温1.5 h后再次洗膜，最后采用ECL化学发光法显影，经Image-Pro Plus 6.0软件进行吸光度测定 ，并与内参β-actin吸光度相比较得到各组蛋白条带相对值。

2 结 果

2.1 各组腺病毒转染后荧光表达情况 腺病毒转染48 h时转染效率>80%，细胞转染48 h与72 h GFP阳性表达的EPCs数量比较差异无统计学意义，但转染72 h时细胞脱落现象更明显，因此，后续采用腺病毒转染48 h的EPCs进行相关实验。详见图1。

图1 腺病毒转染48 h荧光表达情况(MOI=200)(A为正常组；B为对照组；C为转染组)

2.2 下调GLP-1R表达对小鼠EPCs GLP-1R mRNA及蛋白表达的影响 RT-qPCR及Western Blot结果显示：EPCs在转染48 h后，以β-actin作为对照，与对照组相比，转染组GLP-1R mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.01)。详见图2、图3。

与对照组比较，＊P<0.01。图2 各组EPCs中GLP-1R mRNA的相对表达量(n=4)(A为正常组；B为对照组；C为转染组)

与对照组比较，＊P<0.01。图3 各组EPCs中GLP-1R蛋白的相对表达量比较(n=4)(A为正常组；B为对照组；C为转染组)

2.3 下调GLP-1R表达对小鼠EPCs迁移能力的影响 采用Transwell小室法观察下调GLP-1R表达对EPCs体外迁移能力的影响。与对照组相比，转染组EPCs体外的迁移能力明显降低(P<0.01)。详见图4、图5。

图4 细胞迁移实验检测结果(A为正常组；B为对照组；C为转染组)

与对照组比较，＊P<0.01。图5 各组EPCs中迁移细胞相对数量(n=4)(A为正常组；B为对照组；C为转染组)

2.4 下调GLP-1R表达对小鼠EPCs黏附能力的影响 采用黏附实验观察下调GLP-1R表达对EPCs体外黏附能力的影响，与对照组相比，转染组EPCs体外黏附能力明显下降(P<0.01)。详见图6、图7。

图6 各组细胞黏附实验检测结果(A为正常组；B为对照组；C为转染组)

与对照组比较，＊P<0.01。图7 各组EPCs中黏附细胞相对数量(n=4)(A为正常组；B为对照组；C为转染组)

2.5 下调GLP-1R表达对小鼠EPCs衰老的影响 采用β-半乳糖苷酶染色法探讨下调GLP-1R表达对EPCs衰老的影响，与对照组相比，转染组EPCs衰老明显增加(P<0.01)。详见图8、图9。

图8 各组细胞衰老实验检测结果(A为正常组；B为对照组；C为转染组)

与对照组比较，＊P<0.01。图9 各组EPCs中衰老细胞相对数量(n=4)(A为正常组；B为对照组；C为转染组)

2.6 下调GLP-1R表达对小鼠EPCs AKT/eNOS信号通路的影响 各组EPCs在转染48 h后，用Western Blot方法检测AKT/eNOS信号通路的变化情况。与对照组相比，转染组细胞AKT磷酸化水平明显降低(P<0.01)。eNOS是AKT的重要下游基因之一，其磷酸化后参与调控EPCs功能[6-7]。进一步观察p-eNOS蛋白表达情况，结果显示下调GLP-1R表达可明显降低eNOS磷酸化水平(P<0.01)。详见图10～图12。

图10 各组EPCs中AKT、p-AKT、eNOS、p-eNOS蛋白表达电泳图(A为正常组；B为对照组；C为转染组)

与对照组比较，＊P<0.01。图11 各组EPCs中AKT/p-AKT蛋白的相对表达量(n=4)(A为正常组；B为对照组；C为转染组)

与对照组比较，＊P<0.01。图12 各组EPCs中eNOS/p-eNOS蛋白的相对表达量(n=4)(A为正常组；B为对照组；C为转染组)

3 讨 论

研究发现糖尿病病人存在着EPCs数量和功能下降，可能是导致糖尿病病人血管内皮修复能力下降、血管内皮损伤的细胞生物学机制之一[8-9]。因此，积极寻找EPCs功能下降的相关机制是糖尿病血管损伤修复的重要策略，对于减少远期心血管疾病及其相关并发症有重要意义。

越来越多的研究表明，EPCs功能障碍在糖尿病心血管并发症的发生发展中扮演重要角色。然而，其相关的分子机制和综合治疗仍有待阐明。GLP-1R为7次跨膜G蛋白偶联受体，由7α螺旋跨膜域，3个胞外环，3个胞内环，一个胞外N末端和一个胞内C末端构成[10]。现有研究表明：除胰岛外，在小鼠心内膜、血管内皮、平滑肌细胞和心肌细胞中均有GLP-1R分布，其中心内膜分布最多，说明GLP-1R存在于心血管系统的多个部位，也是GLP-1可以作用于心血管系统的结构基础[11-12]。既往研究显示，GLP-1R具有心血管保护作用，并有可能改善2型糖尿病病人的内皮细胞功能障碍[13-14]。本研究观察到下调健康小鼠骨髓EPCs中GLP-1R的表达，可降低EPCs迁移、黏附能力，并诱导细胞衰老。这些结果表明，GLP-1R可能参与EPCs功能活性调控，并参与EPCs介导的血管内皮损伤修复。已有报道显示，AKT/eNOS信号通路参与EPCs的分化和缺血损伤[15-16]。研究证实，在动脉粥样硬化发生发展过程中，通过改变NO通路可影响EPCs增殖、迁移和管腔形成能力[17]。eNOS是调节内源性NO产生的关键酶，受PI3K/AKT信号通路调控[18]。 因此，推测eNOS/NO可能是促进EPCs增殖、黏附、迁移和血管生成的重要途径。为进一步探讨调控机制，通过检测GLP-1R与AKT/eNOS通路之间的关系，发现GLP-1R下调组小鼠EPCs AKT/eNOS磷酸化水平明显降低。这些结果表明GLP-1R很有可能通过调控AKT/eNOS途径从而影响EPCs功能活性。

本研究存在一定的局限性，首先仅在体外细胞实验观察了GLP-1R下调对健康小鼠EPCs功能的影响，今后有待进一步通过动物实验及临床实验探讨GLP-1R对EPCs功能活性的调控作用；其次，对于GLP-1R调控EPCs功能活性的机制，仅检测了GLP-1R下调对AKT/eNOS信号通路的影响，未进行进一步深入的探讨。

综上所述，本研究显示GLP-1R可调控健康小鼠骨髓来源的EPCs功能活性，AKT/eNOS信号通路可能参与了GLP-1R对EPCs功能活性的调控。本研究为进一步发挥GLP-1R及其激动剂在动脉粥样硬化性心血管疾病的防治方面提供了新的理论依据。