根瘤菌对水冬瓜根皮中二次代谢产物的影响

刘承贵，王 凯，李仕外，唐文双，韩忠耀*

(1.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000；2.浙江新和成股份有限公司，浙江 绍兴 312500)

根瘤菌[1-3]在豆科植物与非豆科植物中，通常起固氮增肥，促进植物体、中药材生长及二次代谢产物积累功能。贵州特色民族药水冬瓜根皮，来源于山茱萸科植物有齿鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的干燥根皮，别名水五加、大接骨丹等[4]，在对水冬瓜根皮药材野外调查采样过程中，发现部分区域分布的水冬瓜根部，发生与大豆根瘤菌共生的情况[5]，如贵州都匀小围寨窑洞附近农舍与山脚处，水冬瓜根部大量有根瘤菌的存在情况，结瘤部位主要为侧根。目前，有关山茱萸科植物有齿鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的研究以用药部位根皮部位为主、树皮为辅，根皮中含有紫丁香苷[6-7]、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、黄芪苷、β-谷甾醇、硬脂酸、软脂酸、10-Griselinosidic acid等[8-10]，现代药理实验研究表明，山茱萸科植物有齿鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu树皮部位具有较好的免疫抑制[11-12]、抗炎镇痛[13]等活性，同时，课题组前期对山茱萸科植物有齿鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu根皮部位进行了提取工艺优化[14]、质量控制[15-16]研究等。

查阅相关文献发现，有关共生根瘤菌对水冬瓜根皮二次代谢产物的积累及药材质量的影响与评价，尚无相关报道。因此，本实验采用高效液相色谱法、紫外-可见分光光度法对该药二次代谢产物积累状况开展相关研究，并采用烘干法测定浸出物含量，以期揭示根瘤菌对水冬瓜根皮药材质量的影响。

1 材料与仪器

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)，Agilent Cary 100紫外-可见分光光度计(美国安捷伦科技公司)，电子天平(FA1004B，温州瑞昕仪器有限公司)，Sartorius BT25S电子天平(十万分之一，德国塞多利斯公司)，101-3AB型烘箱等。

1.2 试药

紫丁香苷对照品(购自北京盛世康普化工技术研究院，批号：161214)，芦丁对照品(购自成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-17122001)，乙腈(天津科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)，磷酸(分析纯，重庆川东化工(集团)有限公司)，水为娃哈哈纯净水(浙江娃哈哈集团有限公司)，亚硝酸钠(分析纯，重庆川东化工(集团)有限公司，批号：20130307)，硝酸铝(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20170718)，氢氧化钠((分析纯，重庆川东化工(集团)有限公司，批号为20160101)，其他试剂均为分析纯。

水冬瓜根皮药材、共生根瘤菌水冬瓜根皮药材均为自采，采集地点为贵州省都匀小围寨窑洞区域，自采药材经黔南民族医学高等专科学校赵鸿宾副教授鉴定为山茱萸科植物有齿鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的根皮。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液提取

将自采同株水冬瓜根皮药材根瘤菌部位与正常部位，烘箱烘干后的药材，各取6份，每份约0.50 g，精密称定后，记录称样量，置于圆底烧瓶中，每份加入甲醇50 mL，每份样品回流提取1 h，定性滤纸过滤于50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 紫丁香苷含量测定方法

2.2.1 色谱条件[7]Agela Promosil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，检测波长220 nm，进样量5 μL，柱温35 ℃，体积流量1.0 mL·min-1，流动相为0.50%-磷酸溶液(A)-乙腈(C)，流动相洗脱条件见表1，保留时间为30 min。

表1 高效液相色谱流动相洗脱条件

2.2.2 对照品溶液的制备 取紫丁香苷对照品约8.60 mg，精密称定，加入于50 mL量瓶中，取分析纯甲醇适量，超声溶解，再加入甲醇稀释到刻度，摇匀，得质量浓度为0.172 0 mg·mL-1的紫丁香苷标准品溶液[14]。

2.2.3 供试品溶液 取“2.1”项下各供试品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，续滤液置于液相小瓶中，即得HPLC分析用各供试品溶液。精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5 μL，按照《中华人民共和国药典》(2015版四部，0512高效液相色谱法测定)[16]。

图1 对照品(A)与样品(B) HPLC色谱

2.2.4 线性关系考察 精密量取标准品储备溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL，分别置于25 mL量瓶中，用分析纯甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.2.1”项操作。以峰面积为纵坐标(Y)，溶液的质量浓度为横坐标(X)作线性回归方程，得到紫丁香苷线性回归方程为Y=7 911.4X-12.736(r2=0.999 2)，线性范围为0.034 4～0.516 0 mg·mL-1。

2.2.5 精密度试验 参照文献[7]，测定结果见表2，由表2可知，仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 参照文献[7]，测定结果见表2，由表2可知，供试品溶液在12 h内稳定性较好。

2.2.7 重复性试验 参照文献[7]，测定结果见表2，由表2可知，该方法重复性良好。

表2 方法学考察结果 (n=6，%)

2.2.8 加样回收率试验 参照文献[7]，测得样品平均加样回收率为100.43%，且RSD为1.98%，说明建立的方法回收率较好。

2.2.9 含量测定 精密吸取各供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样分析，含量测定结果见表3。

表3 紫丁香苷含量检测结果

2.3 总黄酮含量测定方法

2.3.1 标准曲线的绘制[14]取芦丁对照品约18 mg，精密称量，移置到50 mL量瓶内，加稀乙醇约为量瓶容积的1/3量，超声溶解后，再加入稀乙醇适量，稀释到刻度，摇匀，即得0.361 mg·mL-1的芦丁标准品贮备液。精密吸取芦丁标准品贮备液0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，用稀乙醇稀释到刻度，摇匀。按照文献[14]方法进行预处理，即可。在510 nm最大吸收波长下，稀乙醇空白调零，以芦丁质量浓度(C值)为横坐标，吸光度(A值)为纵坐标作A-C标准曲线，得芦丁线性回归方程为A=1.375 3C+0.000 24(r2=0.998 4)，结果表明芦丁浓度在0.072 2～1.083 0 mg/mL范围内线性关系良好。

2.3.2 供试品溶液的制备及预处理 按“2.1”项操作，制得供试品溶液后，每份样品，精密移取1 mL于10 mL量瓶中，按照文献[14]方法进行预处理，依次用5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液、4%氢氧化钠溶液，依次进行波长衍生化后，即得总黄酮含量测定供试品溶液，备用。

2.3.3 方法学考察 参照文献[7]，测定结果见表2，由表2可知，仪器精密度和重复性良好，样品在2 h内稳定性较好，可以满足总黄酮含量测定检测时限要求。

2.3.4 总黄酮含量测定 分别取“2.3.2”项下各供试品溶液，用Agient Cary 100紫外-可见分光光度计在510 nm 处分别检测各样品总黄酮含量，检测结果见表4。

表4 总黄酮含量检测结果

2.4 浸出物含量测定

按《中华人民共和国药典》(2015版，四部“2201浸出物测定法”)[17]与课题组前期研究基础筛选的浸出物测定方法[18]，对水冬瓜瓜根皮正常品与根瘤菌样品进行浸出物含量测定，结果见表5。

表5 浸出物含量测定结果 (%)

2.5 含量测定结果分析

由表3、表4、表5可知，同株水冬瓜根瘤菌样本与正常样本二次代谢产物以紫丁香苷与总黄酮为指标评价相比较时，紫丁香苷平均含量分别为2.56 mg/g、0.51 mg/g，降低约5.02倍；总黄酮平均含量分别为0.062 9 μg/g、0.015 2 μg/g，降低约4.14倍。正常品浸出物测定结果无显著性差异，而根瘤菌样品波动较大，有显著性差异。结果表明：水冬瓜根皮药材与根瘤菌共生时，可极大降低其二次代谢产物含量，对该药材二次代谢产物有不良影响。

3 讨论

检测二次代谢产物总黄酮时，首先要确定芦丁标准液最大吸收波长。在200～800 nm波长下进行扫描，发现最大吸收波长为510 nm，因此，将510 nm确定为最大吸收波长。

考察根瘤菌共生对同株药材二次代谢产物影响过程中，与常规对共生植株起增加二次代谢产物含量或促进植物体生长积极作用相反，研究结果表明：同株共生根瘤菌大幅降低水冬瓜根皮药材植物体二次代谢产物含量。同时，尚可通过指纹图谱技术[19-21]，通过比较正常品药材构建的指纹图谱对照图谱与根瘤菌病变药材的相似度，来对药材进行整体性质量评价，相关研究有待进一步深入开展。

综上所述，根瘤菌显著降低了水冬瓜根皮药材中总黄酮、紫丁香苷的含量，而对浸出物结果影响不具有代表性意义，部分根瘤菌样本浸出物含量高于正常部位。由于该药物质基础研究相对薄弱，根瘤菌对其他二次代谢产物的影响情况，在物质基础研究基础上，有待进一步深入研究与考察。