离子液体超声辅助协同萃取中药天麻指标成分的研究

段新新，王莉，吴仁安，邓仕任，夏林波

(1.辽宁中医药大学，辽宁 大连116600；2.中国科学院大连化学物理研究所，辽宁 大连116023)

天麻(GastrodiaelataBlume)为兰科植物天麻的干燥块茎，其气微，味甘，性平，归肝经。天麻具有息风止痉[1]、平抑肝阳、祛风通络的功效，可用于治疗肝风内动、惊痫抽搐、眩晕、头痛、肢体麻木、手足不遂、风湿痹痛等,同时还有抗抑郁的作用[2]。天麻中含有天麻苷、多糖、香荚兰醇、香兰醛、维生素A、琥珀酸、β-谷甾醇、黏液质等多种成分[3]，其中含量较高的主要成分是天麻苷，也称天麻素。天麻素具有镇定和安眠的作用，通常用来治疗头晕目眩、失眠多梦、神经衰弱等。近年来有关天麻的指标成分研究领域比较重视。巴利森苷类成分是由天麻素和柠檬酸组成，具有热不稳定性，酯键易断裂发生降解，在一定条件下，易与天麻素相互转化，且含量远高于天麻素及其苷元[4]。以巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E和巴利森苷G为代表，其结构见图1。

图1 巴利森苷类化合物结构式

目前，天麻中天麻素及巴利森苷类化合物的提取方法主要有超声波提取法[5-6]、浸提法、回流提取法[7-8]、微波萃取[9]和酶解提取法[10]等，提取溶剂主要有甲醇、乙醇、水。这些溶剂提取率低，能耗大，且易造成环境污染等问题。室温离子液体是由一个有机阳离子和一个有机或无机阴离子组成的液态有机盐，与传统有机溶剂相比，离子液体具有极性可调控、热稳定性好，液态范围宽、蒸汽压小[11]等特点，此外离子液体还可根据目标化合物的性质，通过改变阴阳离子的组合或基团的引入以提高对目标化合物的提取率[12]，是一种可替代传统溶剂的新型绿色溶剂[13]，在天然产物提取方面广受关注[14-16]。目前，基于离子液体对天麻指标成分提取的工艺鲜有文献报道。

根据现有文献[17-22]所提到过的天麻的指标成分提取及质量控制，将天麻素及巴利森苷类化合物同时作为天麻指标成分进行考察更为全面。因此，本试验以天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E及巴利森苷G为指标，通过离子液体结合超声辅助的方法对天麻进行提取，并运用质谱法检测研究，通过考察影响提取率的主要因素以确立最佳提取条件。由于不同因素可能对各指标成分提取效果的影响有所不同，因此在后续实验中，以各指标成分离子强度的加和作为主要考察指标来进行提取条件的优化。天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E和巴利森苷G在负离子模式下的质谱参数见表1。

表1 巴利森苷类化合物在负离子模式下的高分辨质谱参数

由于巴利森苷B与巴利森苷C，巴利森苷E与巴利森苷G为同分异构体[26]，因此这4种物质分别考察巴利森苷B与巴利森苷C、巴利森苷E与巴利森苷G离子强度的加和。

1 仪器与材料

1.1 仪器 FSJ-A03D1粉碎机(小熊电器股份有限公司)；QTSXR20500型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；HSE-12B型固相萃取装置(天津市恒奥科技发展有限公司)；HGC-12A型氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)；SolariX XR-15T傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(FT-ICR-MS,Bruker Daltonics,德国)；电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；Centrifuge 5804R艾本德冷冻离心机。

1.2 材料 中药饮片天麻，购于大连市益春堂大药房(西安路店)，产于安徽亳州中强中药饮片有限公司，经中国科学院大连化学物理研究所王莉教授鉴定为中药天麻饮片；甲醇为分析纯；试验用水为超纯水；离子液体1-丁基-3-甲基咪唑乙酸盐([BMIM][CH3COO],纯度98%，深圳市益百顺科技有限公司)；1-丁基-3-甲基咪唑氯盐([BMIM][Cl]，纯度97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；1-丁基氯化吡啶([BPY]Cl，纯度98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

2 方法学考察

2.1 质谱条件 质谱系统采用ESI电喷雾离子源负离子模式扫描：流速2 μL·min-1；扫描范围(m/z)46～1 500；分辨率240 000；雾化气压1.0 bar；毛细管电压4.5 kV；干燥气温度200 ℃，流速4.0 L·min-1；离子累积时间0.1 s。

2.2 精密度试验 取天麻粗粉100 mg,加入1 mL 70%甲醇水溶液，浸泡30 min后超声60 min，离心(4 ℃，14 000 r·min-1)10 min，取上清液，过SPE(C18)柱除去离子液体，水洗后再用甲醇洗脱。将收集到的洗脱液氮气吹干，再加2 mL 70%甲醇水溶液复溶，再次离心后取上清液，按“2.1”项下条件进行质谱检测。连续进样3次，根据各指标成分的离子强度计算RSD。结果天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B/C、巴利森苷E/G的RSD分别为0.82%、1.18%、2.67%和2.85%，表明仪器具有较好的精密度。

2.3 重复性试验 取天麻粗粉3份，其他操作同“2.2”项下。结果天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B/C、巴利森苷E/G的RSD分别为3.88%、13.78%、2.37%、13.46%，3份样品测定值的相对标准偏差均低于15%，表明本法具有较好的重复性。

3 提取条件的考察

3.1 单因素考察

3.1.1 离子液体的考察 取天麻粗粉4份，每份100 mg，放入离心管中，分别加入70%甲醇及浓度为0.5 mol·L-1不同离子液体的70%甲醇水溶液，离子液体分别为[BMIM][CH3COO]、[BMIM]Cl、[BPY]Cl，料液比1∶10，浸泡30 min后超声60 min，离心10 min(4 ℃，14 000 r·min-1)，取上清液，过SPE柱(C18)除去离子液体，水洗后再用甲醇洗脱。将收集到的洗脱液氮气吹干，各加2 mL 70%甲醇水溶液复溶，再次离心10 min(4 ℃，14 000 r·min-1)后取上清液，按“2.1”项条件进行质谱检测，连续进样3次，取平均值，观察不同离子液体提取的天麻指标成分的离子信号强度，结果如图2。

由图可知，[BMIM][CH3COO]、[BMIM]Cl、[BPY]Cl 3种离子液体对天麻素及巴利森苷A、B、C、E、G的提取效果均明显强于70%甲醇水溶液。其中，提取天麻素及巴利森苷A时，[BMIM][CH3COO]的效果最好,其他均为[BPY]Cl的提取效果最好。因3种离子液体与甲醇比较，都具有较高的提取效率，后续将在正交分析中进一步考察三者的影响。

3.1.2 离子液体浓度的考察 取中药天麻粗粉6份，每份100 mg，分别加入浓度为0.05、0.1、0.25、0.5、1、1.5 mol·L-1的[BPY]Cl-70%甲醇水溶液1 mL，其他操作同“3.1.1”项下，考察离子液体浓度对天麻指标成分提取的影响(见图3)。

图3 离子液体浓度对天麻指标成分提取的影响(n=3)

结果表明，[BPY]Cl-70%甲醇水溶液浓度为1.5 mol·L-1时，对天麻素及巴利森苷A的提取效果远高于其他浓度，而其浓度为0.5或1 mol·L-1时对巴利森苷E、G的提取效果更好。此外，离子液体浓度对巴利森苷B及巴利森苷C的提取效率无明显影响。综合6个指标成分的离子强度，选择提取天麻指标成分的[BPY]Cl-70%甲醇水溶液浓度为1 mol·L-1。

3.1.3 甲醇体积分数的考察 取中药天麻粗粉5份，每份100 mg，放入离心管中，加入浓度为1 mol·L-1的[BPY]Cl的甲醇水溶液，甲醇的体积分数分别为30%、50%、70%、90%、100%，其他操作同“3.1.1”项下，考察甲醇体积分数对天麻指标成分提取效果的影响，见图4。

图4 甲醇体积分数对天麻指标成分提取的影响(n=3)

结果表明，[BPY]Cl-甲醇水溶液中的甲醇体积分数为50%时对天麻素及巴利森苷A的提取效果远高于其他，而甲醇体积分数为100%时对巴利森苷B/C、E/G的提取效果较好。综合6个指标成分的提取效果，选择的[BPY]Cl-甲醇水溶液中的甲醇体积分数为100%。

3.1.4 料液比的考察 取中药天麻粗粉4份，每份100 mg，放入离心管中，加入浓度为1 mol·L-1的[BPY]Cl-甲醇溶液，料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20(g·mL-1)，其他操作同“3.1.1”项下，考察料液比对天麻指标成分提取的影响，见图5。

图5 料液比对天麻指标成分提取的影响(n=3)

结果表明，当料液比为1∶5或1∶20时，1 mol·L-1[BPY]Cl-甲醇溶液的对天麻素、巴利森苷A、B、C的提取效果均好于其他，而料液比为1∶5时，对巴利森苷E、G提取效果最好。综合6种指标成分，提取效果最好的料液比为1∶5。

3.2 正交试验优化提取参数 根据上述试验结果，选择离子液体种类(A)、离子液体浓度(B)、提取溶剂甲醇的体积分数(C)、料液比(D)作为因素进行考察，以分子离子峰的相对强度作为考察指标，进行正交试验，不考虑因素间的交互影响，进一步优化天麻中指标成分的提取工艺。正交试验因素水平表如表2所示。由于料液比过小会导致取样困难，因此在本次正交试验中选用料液比1∶5、1∶10、1∶15三个水平进行试验。正交试验结果见表3。

表2 正交试验因素水平表

取天麻粉末9份，每份100 mg，按照4因素3水平正交试验表进行试验设计，在此条件下对天麻中指标成分进行提取，比较总指标成分的分子离子峰相对强度。

由表3中R值可看出，各因素对天麻总指标成分提取量的影响大小顺序依次为：A>C>B>D，即离子液体种类>甲醇体积分数>离子液体浓度>料液比。通过分析可知，离子液体-超声波辅助法提取中药天麻中指标成分较佳的提取条件为：A2B1C1D1，即离子液体[BMIM]Cl，离子液体浓度0.5 mol·L-1，甲醇体积分数50%，料液比1∶5(g·mL-1)。

表3 正交试验结果

3.3 最佳提取工艺验证试验 取天麻粉末3份，每份100 mg，分别以最佳提取工艺(A2B1C1D1)进行萃取，结果3份样品的分子离子峰加和强度分别为1.26、1.31和1.28，平均值为1.28。由数据可知，正交法所得到的离子液体协同超声辅助提取最佳工艺稳定可靠，具有一定的实际应用价值。

4 讨论

离子液体协同超声辅助提取是一种新型、绿色的提取方法，相比于传统溶剂，该方法的提取效率更高，其原理可能为：①离子液体可与被提取物发生氢键作用、疏水作用等分子间作用力[12]；②离子液体对纤维素有良好的溶解能力，细胞壁的主要成分就是纤维素[26]。

试验所用到的傅里叶变换离子回旋共振质谱仪具有分辨率高、精密度好、操作简便快捷等优点，能够很好地检测ESI电喷雾离子源产生的多电荷离子，在中药提取及化合物解析方面具有较高的应用价值及前景。

本试验对中药天麻指标成分的提取工艺进行了考察及优化，该工艺操作简单、节能、环保、高效，是提取天麻素及巴利森苷类化合物的有效方法，为离子液体超声辅助协同提取天麻指标成分提供参考。