单核/巨噬细胞自噬在肝病中的作用研究进展

李敏，沈琴，王晓萍，强磊

(中国药科大学基础医学与临床药学学院，江苏 南京 211198)

肝脏作为机体重要器官之一，发挥着代谢调控、营养储存和解毒作用，肝脏的免疫功能对维持组织和机体的稳态至关重要。当肝脏免疫失调时，来自外界具有危险性的刺激或适当免疫机制会导致病理性炎症，机体更易受到慢性感染、自身免疫性疾病和恶性肿瘤相关的肝脏疾病的侵扰[1]。肝脏巨噬细胞因其在体内稳态平衡和肝病中的重要作用受到越来越多的关注。枯否细胞(Kupffer cells，KC)是肝脏驻留巨噬细胞[2]，约占肝脏非实质细胞的35%，具有“哨岗”功能，在肝脏发生病变时，促炎性单核细胞会转变为巨噬细胞(monocyte derived macrophage，MDM)并大量涌入肝脏组织，参与肝病的发生发展[3-4]。自噬在肝脏中的作用已有众多研究[5-7]，而巨噬细胞自噬在肝病中的作用是目前的研究热点。与自噬在其他疾病中的作用具有两面性不同[8-9]，巨噬细胞自噬在肝脏相关疾病中发挥的保护作用被人们视作治疗肝病的潜在重要手段。

本文主要综述了自噬的过程、自噬对巨噬细胞功能的调控作用以及巨噬细胞自噬在不同肝脏相关疾病发生发展中的作用。

1 自噬的过程

细胞自噬是一种机体必要的、保守的过程。在此过程中，包括可溶性蛋白质、细胞器、大分子复合物和外来异物等在内的细胞中各种成分进行自我降解和代谢，俗称为“自食”(self-eat)[10]。这种细胞内代谢过程在机体稳态中发挥必不可少的作用，其功能障碍参与了多种疾病的发生发展，例如癌症、感染性炎症以及心血管疾病等[11-14]。细胞自噬发生过程有5步[15-17]：①自噬诱导：雷帕霉素靶蛋白复合物1(mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1)活性被抑制，触发自噬相关基因(autophagy-related genes，ATG)13-ATG1/ULK1(Unc-51 like autophagy activating kinase)-ATG17复合物形成并启动自噬[18-19]；②成核：Ⅲ类磷酸肌醇3激酶(class Ⅲ phosphoinositide 3-kinase，PI3K/Vps34)-ATG6/Beclin1复合物介导前自噬体结构(pre-autophagosome structure，PAS)形成；③自噬体延伸：ATG12-ATG5-ATG16复合物在泛素活化酶E1和E2样酶ATG7和ATG10的作用下形成，LC3/ATG8前体经由加工修饰为LC3-I和LC3-II，参与自噬体膜的延伸扩张；④自噬体成熟[20]：自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，内吞体分选复合物(endosomal sorting complexes required for transport(ESCRT)、Ras样GTP酶(Ras-like GTPases，Rabs)[21]、溶酶体相关膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein1，LAMP1)、LAMP2等参与了此过程⑤自噬体裂解。有两种基因修饰小鼠模型可用于自噬的体内研究：“自噬缺失小鼠”和“自噬监测小鼠”[22]。评价自噬在体内发挥的作用与自噬过程监测对于更好地利用自噬诊断和治疗人类疾病具有重要意义。

2 自噬在单核/巨噬细胞中的作用

在机体稳态生理条件下，单核/巨噬细胞普遍存在于各种组织和体腔中，是先天免疫的重要组成部分之一，参与多种慢性炎症和相关病理过程[23-24]。有研究表明，集落刺激因子2(colony stimulating factor 2，CSF2/GM-CSF)可激活mTOR信号通路，抑制自噬，从而促进小鼠髓系祖细胞分化为巨噬细胞(见图1)[25]；小鼠造血系统敲除Atg7(Atg7flox/flox;Vav-Cre)可导致循环外周血和组织驻留髓祖细胞数量增加[26-27]。以上结果都证明抑制自噬可以促进造血干细胞和祖细胞分化为巨噬细胞。然而，小鼠髓系敲除Atg7(Atg7flox/flox;Lyz-Cre)与野生型小鼠相比外周血并无明显骨髓增殖，可能是由于髓系细胞仅限于粒细胞、单核细胞和成熟巨噬细胞，而包括干细胞和祖细胞在内的早期造血干细胞仍旧保持了完整的Atg7等位基因[28]。另外有研究表明自噬阻止了单核细胞的凋亡，促进了单核细胞分化为巨噬细胞[29]。可见自噬在巨噬细胞成熟分化的不同阶段起到了不同的作用，具体机制有待进一步阐明。

图1 自噬对骨髓来源的巨噬细胞功能的调控

自噬除了与巨噬细胞的成熟分化相关外，也对其诱导极化具有重要意义。骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow derived macrophages，BMDM)向M2型极化依赖于自噬，并由核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)自噬性降解介导，该过程依赖p62/SQSTM1[30-31]。Roca等[32]的研究发现肿瘤微环境中趋化因子2(CC chemokine-2，CCL2)和白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)增强了自噬，促进了人外周血来源的髓系细胞发生M2表型极化。此外，在肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAM)的研究中发现，溶酶体蛋白酶组织蛋白酶S介导的自噬促进TAM向M2极化，有助于肿瘤生长和转移，加速肿瘤恶化[33]。然而，自噬直接调节巨噬细胞极化相关信号通路，还是调节巨噬细胞极化过程中关键蛋白质的降解，仍需进一步探究。

自噬还会影响巨噬细胞相关蛋白质的分泌和表达。巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一种由巨噬细胞表达的促炎性细胞因子。巨噬细胞Atg5被抑制后，由单核细胞和巨噬细胞分泌的MIF增多，此过程依赖于线粒体活性氧[34]。Atg5flox/flox;Lyz-Cre小鼠在受到结核杆菌感染后IL-1α、IL-12和CXC趋化因子1(C-X-C Motif Chemokine Ligand 1，CXCL1)都升高，但是公认的促炎性细胞因子干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)却没有改变[35]。可见，自噬在细胞因子的产生过程中并非一般炎症刺激的结果，可能与更具体的机制相关。

3 巨噬细胞自噬参与肝脏相关疾病的发生发展

3.1 肝损伤 肝损伤发生时除了对肝细胞造成首要直接损害外，还会引起诸多免疫反应引发的细胞因子的释放[36]。尽管KC和MDM介导了肝损伤后的组织重塑和修复，巨噬细胞的过度激活仍旧是形成肝细胞损伤的基础[1,37-38]。

内毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌内毒素重要成分，可直接或间接参与包括肝炎在内的多种肝病的发病进程；D-半乳糖胺(D-galactosamine，D-GalN)会引起肝弥漫性坏死和肝脏炎症，和临床病毒性肝炎的病理性变化相似。LPS/D-GalN诱导的急性重症肝炎常作为一种动物模型用于研究急性肝损伤的生理、毒理机制[39-40]。有研究表明，相比野生型小鼠，LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤在Atg5flox/flox;Lyz-Cre小鼠中表现的更为严重，血清IL-1β明显升高，阻断IL-1β受体信号通路后肝损伤减轻，巨噬细胞自噬可通过抑制炎症小体依赖性IL-1β的产生抑制LPS/GalN诱导的急性肝损伤[41]，该自噬过程受生长阻滞特异性蛋白6(growth arrest-specific protein 6，GAS6)-受体酪氨酸激酶AXL调控[41]。此外，巨噬细胞中窖蛋白(caveolin-1，Cav-1)介导的Notch1/HES1(hairy/enhancer of split 1)信号通路的激活对自噬的调控介导了超顺磁性葡聚糖氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)对巨噬细胞IL-10分泌的促进作用，抑制了炎症，改善了LPS诱导的肝损伤[42]。在硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)诱导的急性肝损伤中，KC沉默Atg5后，促炎因子分泌升高，KC向M1型极化，精胺(spermine，SPM)刺激KC自噬水平升高，抑制其M1极化，从而改善了肝损伤[43]。

酒精性肝病(alcoholic liver damage，ALD)是一个复杂的过程，酒精性肝炎是所有ALD中最严重的一种[44]，ALD动物模型主要表现为脂肪变性和中度炎症，而人类患者恶化为肝硬化甚至是肝衰竭才会被患者发现。酒精会影响自噬过程中的多个基因，干扰自噬流[45-46]。KC在慢性酒精诱导的早期肝损伤中起到至关重要的作用。给予小鼠KC抑制剂GdCl3可部分显著改善肝功能，减少脂滴蓄积[47]。大麻素受体2(cannabinoid receptor 2，CBR2)对酒精诱导的肝损伤的保护作用是通过对KC的激活调节实现的，其通过血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)诱导的自噬依赖途径抑制肝脏炎症反应改善肝损伤[48]，CB2激动剂在Atg5flox/flox;Lyz-Cre小鼠中对肝脏的保护作用被逆转强调了巨噬细胞自噬的必要作用。酒精喂养小鼠6周后，Atg7flox/flox;Lyz-Cre小鼠表现为更严重的线粒体活性氧产生过剩，IL-1β、CCL5、CXCL10分泌增加和脂肪病变[49]。机制研究表明，胞内干扰素调节因子(interferon regulatory factor，IRF)水平受到降解性自噬调节，而由TLR4-TRIF介导的IRF的表达可调节CCL5和CXCL10的分泌[49]从而影响肝损伤进程。

3.2 肝纤维化 肝纤维化关键环节为肝脏星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)的激活[50]，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度蓄积使肝脏结构发生可逆性改变。需要特别关注的是促炎性巨噬细胞的浸润和极化以及促炎性细胞因子的产生可直接激活HSC，从而促进肝纤维化的发展。肝纤维化发生时KC细胞中T细胞免疫球蛋白域与粘蛋白域-4(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-4，TIM-4)表达增多，对TIM-4的干扰抑制了蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)介导的活性氧的产生，导致PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)-Parkin、LC3-II/I的激活抑制和转化生长因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)的分泌减少[51]，通过介导Akt1/线粒体自噬信号通路，抑制TIM-4可对抗CCl4诱导的肝纤维化。近期研究[52]指出，抑制巨噬细胞中单酰甘油脂酶(monoacylglycerol lipase，MAGL)对肝纤维化的改善依赖于自噬。Atg5flox/flox;Lyz-Cre小鼠原代KC中IL-1α和IL-1β分泌增多，导致肝细胞凋亡增多[53]。肝细胞凋亡是慢性肝病的一个常见特征，它通过促进肝肌成纤维细胞存活和增强其成纤维原性来促进纤维化过程[54]。肝纤维化患者或肝硬化患者的肝单核细胞中LC-3相关的吞噬作用(LC3-associated phagocytosis，LAP)增强，对LAP进行抑制肝脏炎症加重，肝纤维化恶化[55-56]。机制研究表明，LAP诱导的抗炎和抗纤维化信号通路是由于Fc免疫受体FCGR2A/FcγRIIA表达增强和FCGR2A介导的PTPN6/SHP-1抗炎通路的激活，导致LC3+吞噬小体对IgG的吞噬增加。然而有研究表明，对HSC自噬的抑制可以阻碍其激活，发挥抗肝纤维化的作用[57-58]。因此，由于自噬在肝纤维化中具有细胞特异性的作用，利用自噬途径进行细胞特异性药物递送系统的设计，必定是将自噬作为抗纤维化治疗的潜在靶点值得考虑的条件。

3.3 其他相关肝病 给予高脂饲料喂养的小鼠LPS刺激后，Atg5flox/flox;Lyz-Cre小鼠出现肝脏特异性炎症，而没有更严重的脂肪组织炎症[59]，自噬缺失调节巨噬细胞向M1极化从而促进了肥胖相关的炎症反应。在MCD(methionine-choline-deficient)饮食喂养构建的小鼠非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)模型中，巨噬细胞内缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor，HIF-1α)水平升高，HIF-1α介导了NF-κB的激活和CCL2的释放，以及HIF-1α介导的巨噬细胞自噬受损增加了IL-1β的产生[60]。然而，自噬的激活需要NF-κB的参与[61]，HIF-1α介导的NASH是否为巨噬细胞自噬与NF-κB的共同作用还有待进一步研究。

癌症的发病率和死亡率总体上在下降，但肝细胞癌的发病率和死亡率都在上升[62]。自噬缺失的KC在肿瘤形成前阶段更易促进肿瘤发生，此过程是线粒体活性氧-NF-κB-IL-1α/β依赖性的[63]。TAM向M1型再极化具有免疫活性，有利于肿瘤消退。研究表明一种天然化合物黄芩苷通过促进TAM向M1再极化，促进促炎性细胞因子的释放，抑制肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发生发展，此过程自噬水平升高，介导了TNF受体相关因子2(TNF receptor-associated factor 2，TRAF2)的p62依赖性自噬降解，引起NF-κB2通路转录激活[64]。

4 总结与展望

肝脏是机体重要的代谢器官之一，机体80%～90%的固有巨噬细胞存在于肝脏[65]，其对免疫反应的正确调控具有关键作用，参与了肝脏各种生理病理过程。肝脏发生病变时，主要有两种来源的巨噬细胞发挥作用，分别是来自于肝脏固有驻留巨噬细胞和外周血的单核细胞分化而来的巨噬细胞。巨噬细胞在肝病中既具有促进炎症或加重损伤的作用，又具有抗炎或促进修复和促进纤维化的作用，其功能与巨噬细胞状态直接相关，巨噬细胞的功能转变受到多种刺激和周围环境的调控。作为一种天然的细胞防御生理过程，自噬参与了先天免疫反应。大量研究揭示了自噬与巨噬细胞的功能调控具有密切联系：从巨噬细胞分化到巨噬细胞诱导极化，再到细胞因子的释放和炎症反应，巨噬细胞几乎所有的功能都与自噬相关。尽管对巨噬细胞自噬在肝病中的作用研究越来越多，但仍旧存在诸多尚未解决的问题，例如：不同肝病中，自噬调节巨噬细胞功能的具体作用机制；由于自噬在不同细胞中作用的差异，如何靶向特定细胞设计调控自噬的药物；自噬如何调控巨噬细胞成熟分化的不同阶段等，这些问题的提出与解决将为以巨噬细胞自噬为靶标预防和治疗肝病提供全新的探究方向。