黄芩素通过Ezrin相关信号转导通路对喉癌细胞迁移、侵袭的影响

孙吉凤 何海涛

(1长春医学高等专科学校，吉林 长春 130031;2吉林大学基础医学院)

喉癌是头颈部常见恶性肿瘤，统计数据表明全世界每10万人中有5.1～10.0 例喉癌患者〔1〕，约60%的喉癌患者确诊时已处于Ⅲ期或Ⅳ期〔2〕,手术仍是喉癌治疗的主要手段，手术切除辅助放疗、化疗、新型靶向治疗等综合手段治疗也越来越多被采用〔3,4〕，我国目前90.34%的喉癌患者生存率不超过5年，且复发、浸润和转移是影响预后的主要因素〔5〕。

Ezrin与肿瘤转移存在密切关系，相关研究越来越受到学者重视〔6〕。有研究表明〔7,8〕，Ezrin在喉癌转移灶中的表达高于原发灶，在促进喉癌侵袭和转移的过程中表达量持续增高，但深入的相关分子机制研究目前尚未见报道。中药黄芩在治疗喉癌方面的作用早在《黄帝内经》中即有介绍〔9〕。黄芩素(BAI) 作为黄芩的主要有效成分，在抗肿瘤方面的研究近年也有报道〔10〕，本科研团队孙吉凤等〔11〕研究表明BAI可以影响喉癌Hep-2细胞周期分布，诱导细胞凋亡。有研究表明，Ezrin在喉鳞状细胞癌组织中的高表达与肿瘤侵袭相关〔12〕。本研究拟分析BAI通过调节Ezrin相关信号转导通路对喉癌细胞侵袭、转移的影响。

1 材料及方法

1.1细胞与试剂 人喉癌Hep-2 细胞株购于上海细胞生物研究所。BAI购于美国SIGMA公司，用二甲基亚砜(DMSO)溶解。RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶等细胞培养用试剂购于美国Gibco/BRL公司。四甲基偶氮唑盐(MTT)购于北京鼎国生物技术公司，Transwell小室购于美国Corning-Costar公司，Trizol 试剂购于美国Invitrogen 公司，Prime Scri PtRT Master Mix 购于Takara公司，Ezrin、RhoA基因引物由Takara公司合成，p-Ezrin、Ezrin、RhoA抗体购于美国Santa Cruz公司，GAPDH抗体、二抗购于博士德公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、化学发光(ECL)检测试剂盒购于凯基生物技术公司。

1.2细胞培养 喉癌Hep-2细胞株于含10% FBS、100 U/ ml青霉素及100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，37℃，全湿度，5%CO2孵箱中传代培养，实验选择对数期细胞。

1.3MTT实验 收集对数期生长的喉癌Hep-2细胞，按细胞浓度为5×104个/孔，接种于96 孔培养板中，每孔加100 μl 细胞悬液，培养24 h后，加入终浓度分别为10、20、40、80 μmol/L的BA继续培养；设阴性对照组(只加入溶剂DMSO)及设空白对照组；每组设5个平行复孔。继续培养24、48、72 h后,每孔加入20 μl MTT(5 g/L)，孵育4 h，弃上清，加入150 μl DMSO,振荡，待蓝紫色结晶物完全溶解后,酶标仪在490 nm 波长处检测各孔吸光值(A)。细胞增殖抑制率(IR)=(1-药物作用组平均A/对照组平均A)× 100% ，并计算出BAI的50%抑制浓度(IC50)。

1.4划痕愈合实验 取对数期生长的喉癌Hep-2细胞,按细胞浓度为2×105个/孔接种于6孔培养板，放置细胞培养箱中培养 24 h后使其形成单层细胞。用 200 μl无菌枪头垂直于板底给6孔板中的细胞划痕，记录划痕区相对距离。用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗去脱落细胞,分别加入BAI溶液(终浓度为10、20、40 μmol/L)，继续培养24、48 h后，观察并拍照，在倒置显微镜下测量细胞向划痕区迁移的相对距离，并计算细胞迁移率。0 h时划痕宽度作为对照组，细胞迁移率 = (对照组划痕宽度-实验组划痕宽度)/0 h时划痕宽度×100%。每组设3个复孔，设阴性对照组，实验重复3次。

1.5Transwell侵袭实验 将基质胶铺于 Transwell 小室的上室，并于 37℃环境孵育1 h。取对数期生长的喉癌Hep-2细胞，用无血清RPMI1640培养液调整细胞浓度为2×105个/L ，将200 μl细胞悬液加至 Transwell小室(孔径8 μm)上室，各实验组分别加入BAI溶液(终浓度10、20、40 μmol/L)，同时设阴性对照组。下室加入600 μl含10%FBS的RPMI1640培养液。培养24 h后,去除上下层培养液,将 Transwell 小室取出，用棉签擦去小室表面未侵袭的细胞和基质胶，用甲醇固定20 min，PBS洗涤2次，用0.1%结晶紫溶液染色20 min，PBS洗涤2次，待其自然晾干后,倒置显微镜下随机选取5个视野拍照,统计各组穿膜的平均细胞数及细胞侵袭抑制率，细胞侵袭抑制率=(对照组穿膜细胞数-实验组穿膜细胞数)/ 对照组穿膜细胞数×100%。

1.6RT-qPCR检测 取对数期生长的喉癌Hep-2细胞分别加入BAI(终浓度为20、40、80 μmol/L)，设阴性对照组，继续培养至24 h或48 h，用Trizol裂解细胞提取细胞总RNA，利用微量分光光度计检测A260/A280鉴定提取纯度，定量后各组取2 μg总RNA逆转录获得cDNA，用Real-Time PCR仪进行荧光实时定量PCR反应，按照试剂盒操作说明书进行20 μl反应体系反应。各基因的合成引物分别为：Ezrin正义链5′-TGGGATGCTCAAAGATAATGC-3′,反义链5′-ACTCCAAGCCAAAGGTCTGTT-3′;RhoA正义链5′-TTCAGCAAAGACCAA-AGATGGA-3′,反义链5′-CACAAGACAAGGCACCCAGA-3′,以GAPDH为内参GAPDH正义链5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′,反义链5′-ATGGTGGT-GAAG-ACGCCAGGTA-3′。

1.7Western印迹检测 取对数期生长的Hep-2细胞加入终浓度为40、80 μmol/L的BAI，设阴性对照，继续培养至24 h或48 h，按试剂说明书操作，收集细胞，PBS洗涤后，RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白，收集上清液，BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取含50 μg总蛋白样本与十二烷基硫酸钠(SDS)混合变性后，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。电泳后蛋白转聚偏氟乙烯(PVDF)膜，然后5%脱脂牛奶4℃ 摇床封闭；充分洗膜后，加稀释后的p-Ezrin、Ezrin、RhoA和内参GAPDH抗体(按1∶1 000稀释)4℃ 孵育过夜；充分洗膜后，加稀释后的HRP-鼠抗兔IgG(按1∶2 000稀释)37℃ 孵育2 h；充分洗膜后，加ECL显色定影；之后利用BIO-RAD凝胶成像及分析系统对各蛋白条带进行分析，实验反复3次。

1.8统计学方法 采用SPSS22.0 软件进行方差分析、t检验，用 Graph Pad Prism 进行绘图。

2 结 果

2.1BAI对Hep-2细胞增殖的影响 MTT实验结果显示，与阴性对照相比，BAI(10、20、40、80 μmo/L)作用 24、48、72 h后，对各组细胞增殖均具有抑制作用，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 BAI作用不同时间对Hep-2细胞增殖抑制率的影响

2.2BAI对Hep-2细胞迁移能力的影响 与阴性对照组相比，24、48 h各浓度细胞迁移率显著降低(P<0.05)；且相同浓度组的细胞迁移率，随作用时间增加而降低。见表2。

2.3BAI对Hep-2细胞侵袭能力的影响 BAI处理组穿膜细胞数减少，细胞侵袭能力明显减弱。与阴性对照组相比，BAI作用24 h 后，各浓度组穿膜细胞数逐渐减少，细胞侵袭率逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 BAI对 Hep-2细胞迁移能力的影响

2.4BAI对 Hep-2细胞Ezrin、RhoA基因 mRNA表达的影响 RT-qPCR检测结果显示，与阴性对照相比，BAI(20、40、80 μmol/L)作用 24、48 h后，各组细胞Ezrin、RhoA基因 mRNA相对表达量下降。组间比较随BAI浓度及作用时间的增加，Ezrin、RhoA mRNA表达相对密度显著降低(P<0.05)。见表4。

表3 BAI对Hep-2细胞侵袭能力的影响

表4 BAI对 Ezrin、RhoA mRNA相对表达的影响

2.5BAI对p-Ezrin、Ezrin、RhoA蛋白表达的影响 与阴性对照组相比，40、80 μmol/L BAI作用24 h后磷酸化Ezrin(p-Ezrin)蛋白表达明显降低(P<0.05)；但40 μmol/L BAI作用组与80 μmol/L BAI作用组间差异无显著意义(P>0.05)；40、80 μmol/L BAI作用后Ezrin蛋白表达明显低于对照组，且随浓度升高表达降低(P<0.05)；40、80 μmol/L BAI作用后RhoA蛋白表达明显低于对照组，且随浓度升高表达降低(P<0.05)。与阴性对照组相比，40、80 μmol/L BAI作用48 h后p-Ezrin、Ezrin、RhoA蛋白表达明显降低(P<0.05)，且各48 h作用组蛋白表达量明显低于24 h(P<0.05)。见图1、表5。

图1 BAI对各组细胞Ezrin、p-Ezrin、RhoA蛋白表达的影响

表5 BAI对 p-Ezrin、Ezrin、RhoAm蛋白相对表达的影响

3 讨 论

BAI是黄芩的主要有效成分，近年其抗乳腺癌、宫颈癌、甲状腺癌等作用被报道。本研究团队前期研究结果表明，黄芩素具有影响细胞周期分布、诱导喉癌细胞凋亡方面的作用〔11,13〕。

肿瘤的发生与细胞增殖、细胞凋亡失衡密切相关，诱导癌细胞凋亡，抑制癌细胞增殖也是抗肿瘤的主要研究方向。本研究结果表明，BAI对喉癌Hep-2 细胞具有增殖抑制和诱导凋亡的作用。

我国目前绝大部分的喉癌患者5年生存率较低，其中癌细胞的浸润和淋巴结的转移是影响喉癌预后、生存率的关键因素。因此抑制肿瘤细胞转移是提高生存率的关键。本研究结果表明，BAI可以抑制喉癌Hep-2 细胞迁移能力及侵袭能力。

肿瘤的浸润与转移是多系统、多步骤和多因素作用的结果。近年来，Ezrin与肿瘤转移的密切关系，越来越受到学者重视，成为抗肿瘤治疗的全新靶点〔6～8〕。Ezrin是ERM家族蛋白最早被发现的，ERM家族蛋白参与调节细胞迁移、细胞增殖、细胞黏附、细胞骨架重塑及肿瘤细胞的转移侵袭等。Ezrin 参与许多细胞信号传导过程，研究表明Ezrin的异常表达及磷酸化与多种恶性肿瘤转移密切相关〔7〕。有研究显示Ezrin在喉癌转移灶中的表达高于原发灶，其与促进喉癌侵袭和转移密切相关〔12〕。但深入的相关分子机制研究目前尚未见报道。本研究结果表明BAI呈浓度-时间依赖性，抑制喉癌Hep-2 细胞Ezrin基因及p-Ezrin的表达。Ezrin蛋白的磷酸化激活是Ezrin发挥其对细胞骨架动态循环调控功能的必需条件，结合BAI抑制喉癌Hep-2 细胞迁移能力及侵袭能力的结果，说明BAI可以通过抑制Ezrin在mRNA、蛋白水平表达及Ezrin磷酸化，可能与抑制喉癌Hep-2 细胞迁移及侵袭相关。

RhoA是一种结构较为保守的单体G蛋白，具有GTP酶活性，研究已经证实，RhoA作为Ezrin上游活化信号通路及下游相互作用蛋白之一，在多种恶性肿瘤中高表达，并参与肿瘤细胞的增殖、浸润转移等过程〔14〕。有研究表明，RhoA在喉鳞状细胞癌组织中的表达增加，且其表达水平与肿瘤的分化程度、浸润程度、有无淋巴结转移及分期密切相关〔12〕。本研究结果表明BAI可以抑制喉癌细胞中RhoA基因的表达。RhoA是 Ezrin上游调控因子，活化的RhoA通过介导细胞表面分子RhoA/ROCK-I信号通路促进Ezrin的磷酸化，促进Ezrin活化，增强 Ezrin与细胞骨架的联系，在肿瘤的转移过程中发挥重要作用。活化的Ezrin同时可以正反馈调控RhoA，Ezrin可以通过与Rho-GDI结合从而活化RhoA，也可以通过激活 Rac1从而激活Rho信号通路。

综上，BAI可以抑制喉癌Hep-2细胞的迁移、侵袭，这可能与抑制RhoA在mRNA和蛋白水平的表达有关，进而抑制RhoA/ROCK-I信号通路，抑制Ezrin的磷酸化，进而抑制Ezrin的表达；此外，对Ezrin表达的抑制作用，将抑制Ezrin与Rho-GDI结合，抑制RhoA活化，也可以抑制Rac1激活，从而抑制Rho信号通路，抑制喉癌Hep-2细胞的迁移、侵袭。