ApoE基因缺陷与SD大鼠急性脑缺血模型稳定性比较

王雄 邬玉芹 陈红 张武 何占平 陈泽谷 夏鹰 余丹 陈晶

(海口市人民医院暨中南大学湘雅医学院附属海口医院，海南 海口 570208)

随着分子生物学发展，利用基因缺陷动物建立相关模型已成为科研工作的重要方向〔1〕。本研究结合国内外多个实验室建立缺血性脑卒中模型的经验〔2～4〕，利用改良线栓法建立载脂蛋白(Apo)E基因缺陷大鼠和野生型大鼠局灶性缺血模型，依据建模成功率、神经功能评分、磁共振成像(MRI)影像学表现对模型的成功率和稳定性进行评价，旨在探讨建立稳定的脑卒中动物模型，更好地为缺血性脑卒中机制研究和治疗效果的评价提供切实可行的基础和前提。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选用雄性ApoE(-/-)基因剔除大鼠100只，SPF级雄性SD大鼠100只，年龄约6周龄且体重为0.18～0.22 kg，本实验中使用的大鼠购自湖北省疾病预防控制中心，动物均可自由摄食标准饲料和自来水，置于12/12 h光/暗周期环境下24℃安静温控动物房笼中(每笼5只大鼠)饲养，相对湿度45%左右，通风良好，每笼3～5只饲养，依据大鼠品系分为两组。

1.2动物模型制备 局灶性脑缺血再灌注模型制作参照文献等〔5〕方法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,根据文献等〔6,7〕的5分制评分标准，本研究评分采用双盲法，由未参与实验分组者完成，防止选择偏倚影响实验结果的准确性。本实验选择2～3分模型作为实验对象。对照组和实验组动物模型均在术后3 d和7 d再次进行评分，评价神经功能状态。脑梗死灶范围测量采用双盲法用图像处理软件(Image-Pro Plus6.0)测量和计算梗死脑组织的体积百分比，MRI数据采集使用美国GE公司signa HDX 3.0 T MR机扫描,上海辰光医疗科技有限公司生产的专用相控阵实验动物线圈(大鼠，5 cm孔径)对大鼠行颅脑MRI扫描。将两组缺血性脑卒中动物模型均在缺血24 h、3 d和7 d时行MRI扫描，均行MRI-DWI、T2WI、PWI扫描，动态观察不同MR扫描序列不同扫描时间的影像表现情况。

1.3缺血性脑卒中动物模型成功的神经病学标志 手术侧表现出Honer征，出现强迫体态和对侧前肢偏瘫，爬行时向偏瘫侧转圈、追尾现象等〔8〕。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0软件进行χ2检验、单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1不同类别大鼠缺血性脑卒中动物模型行为学评分 ApoE基因缺陷组75只成功大鼠模型，缺血再灌注后3 d NSS评分显著高于7 d(P<0.001)；缺血再灌注后3 d及7 d BWT评分无统计学差异(P=0.393)。SD组73只成功大鼠模型，缺血再灌注后3 d、7 d NSS、BWT评分差异有统计学意义(P<0.001)；见表1。

表1 两组NSS、BWT评分比较分)

2.2MRI 在MR-DWI及T2WI图像上均能看到缺血侧与对侧(非缺血侧)影像存在明显差异，但缺血区域均表现为明显的高信号，两组DWI序列显示缺血灶边界较T2WI更加清晰；ApoE基因缺陷组与SD组1、3、7 d脑缺血容积百分比分别为16.5%、18.5%、10.5%和9.0%、11.0%、5.5%，相同时点两组间差异均有统计学意义(均P<0.05)；两组缺血动物模型范围先随时间推移呈扩大趋势，然后缺血范围呈现不断缩小趋势；各时间点SD组缺血范围均较ApoE组大且明显，由缺血24 h到7 d内缺血灶变化范围ApoE组更为明显。两种模型制作成功后MRI扫描清晰显示大鼠脑组织缺血及水肿情况，T2WI和DWI均呈显著高信号，于缺血手术后1 w水肿达高峰期，ApoE基因缺陷组与SD组1、3、7 d两侧大脑半球不对称百分比分别为-4.5%、7.0%、6.5%和-5.0%、10.0%、-4.5%，相同时点两组间差异均有统计学意义(P<0.05)。两侧大脑半球比值方向发生明显变化。随时间推移，水肿程度呈不同程度缓解，T2WI信号逐渐减低，以缺血灶周边明显，梗死中心区脑组织逐渐液化；弥散系数b=1 000时的DWI图高信号为新鲜梗死区，缺血再灌注3 d内信号及缺血容积均呈上升趋势，提示水肿逐渐加重，7 d后信号逐渐降低，提示水肿有所减轻。见图1及图2。

图1 两组脑卒中动物模型不同MRI扫描序列影像随扫描时间的变化

图2 两组不同时点MRI-DWI

3 讨 论

本研究结合国内外多个实验室经验，不断优化实验条件，ApoE基因缺陷大鼠与SD大鼠两组模型3 d内成功率高分别为76%和77%。成模过程中大鼠死亡的原因多为蛛网膜下腔出血、麻醉过度、由于对气道或迷走神经刺激过多过重致气道分泌物多从而呼吸困难和窒息死亡、梗死面积过大〔9〕；神经功能缺损评分过低的大鼠可见脑部无梗死，可能为大脑中动脉闭塞不完全，早期出现不慎再灌注或梗塞范围很小，多为大脑中动脉更小的分支供血区〔10〕。

通过Zea-Longa评分对ApoE基因缺陷与SD组MCAO模型的行为时间稳定性进行评价，术后ApoE基因缺陷大鼠模型NSS评分7 d比3 d有所降低，考虑与梗死后水肿逐渐改善致功能缺损有一定程度恢复有关，但横木行走试验改善不明显，难度大的测试可以使恢复程度更难辨别；SD组NSS及WBT评分3 d与7 d差异明显，神经功能评分从行为学角度说明SD大鼠模型的行为稳定性较ApoE转基因大鼠MCAO模型的稳定性差。MRI-DWI的物质基础是组织中水分子无规则的热运动，也是目前测量活体水分子扩散运动成像的唯一方法。对两种脑缺血动物模型均行MRI-DWI扫描，对比SD和ApoE(-/-)DWI影像发现，随着时间推移SD组栓塞侧脑组织高信号范围变化较ApoE(-/-)大而明显，特别是MRI灌注融合图像能够清晰显示两种模型的缺血核心和缺血半暗带范围差异。不少学者认为缺血半暗带恢复血供后可恢复正常功能，不少学者认为缺血半暗带的存在对于缺血再灌注和临床溶栓时间窗的把握有重要意义〔5，11〕。MRI从形态影像学角度证实了SD大鼠模型形态影像的稳定性较Apo-E转基因大鼠模型稳定性差。本研究结果显示，ApoE基因缺陷大鼠模型的时间稳定性明显优于SD大鼠模型。

综上，可用ApoE基因缺陷大鼠制备稳定、可重复性强、操作相对简单、创伤小、成功率高的大鼠模型，为进一步研究缺血性脑卒中的病因病机及治疗方法提供良好的技术支持。ApoE基因缺陷大鼠制备缺血性脑卒中动物模型，与人群常见缺血性卒中发病过程类似，且稳定性较好，能够很好地模拟人缺血性脑卒中发病的病理生理机制，在脑卒中机制和临床研究中有广阔的应用前景。