阿霉素致大鼠慢性心力衰竭模型建立

张译心 纪凤兰 王鑫 王晓 刘博 温富春 丁涛 徐惠波

(1长春中医药大学，吉林 长春 130117；2吉林省中医药科学院)

慢性心力衰竭(CHF)常见于各种心血管疾病的终末期阶段，是一种具有高患病率和高死亡率的临床常见病〔1〕。阿霉素(ADR)属于蒽醌类药物，是临床常用的一种高效肿瘤化疗药物，长期使用可损害机体的心肌组织，具有严重的心脏毒性，引发剂量依赖性不可逆的心肌损害和CHF〔2～4〕，因此ADR致大鼠CHF动物模型已经成为基础研究中常采用的动物模型。虽然该模型应用的文献报道很多，但方法不一，多种多样，也无统一的评价标准，本实验通过采用ADR不同的造模方法，建立稳定的大鼠CHF模型，并以治疗CHF的阳性药芪苈强心胶囊对造模结果进行验证，旨在建立一种稳定可重复的ADR诱导CHF动物模型，并规范模型评价指标，为该模型在药理学研究中更好应用提供方法学依据。

1 材料与方法

1.1药物与试剂 ADR：批号：1703E3、1909E1，由深圳万乐药业有限公司经销；芪苈强心胶囊：批号：A1807004，由石家庄以岭药业股份有限公司经销。

注射用生理盐水购自吉林康乃尔药业有限公司；乌来糖购自国药集团化学试剂有限公司；肝素钠购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；甲醛购自天津市北联精细化学品开发有限公司；甲醇购自北京化工厂；二喹啉甲酸(BCA)总蛋白定量测试盒购自南京建成生物工程研究所；B型利钠肽(BNP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自RD公司；RIPA、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样缓冲液、Tris液、TBST均购自康为世纪生物科技有限公司；GAPDH(G-9)IgG1、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2(C-2)IgG1、Bcl-2相关X蛋白(Bax)(B-9)IgG2b、Caspase-3(C-2)IgG2a均购自Santa Cruz公司；TUNEL试剂盒购自美国Roche公司。

1.2动物 健康7周龄SPF级Wistar大鼠，雌雄均可，体重(220±20)g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司〔SCXK(吉)-2016-0003〕，饲养于吉林省中医药科学研究院屏蔽环境动物室〔SYXK(吉)2015-0009〕，本实验经过吉林省中医药科学院动物伦理委员会批准实施，伦理审批号JLSZKYDWLL2019-001。

1.3仪器 多导生物记录仪(AD仪器公司产品)，酶标仪(BioTek仪器有限产品)，紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司产品)，高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司产品)，六一电泳仪(北京市六一仪器厂产品)，Imager(Ultra-Violet Products Ltd产品)，石蜡切片机及石蜡包埋机(德国 Leica 公司产品)，光学显微镜(日本 Olympus 公司产品)，图像分析系统(日本NIKON公司产品)。

1.4造模与分组 Wistar大鼠182只，试验分3批进行，每批均分空白组、模型组、阳性药组，随机分组，共计9组。具体分组、造模及给药方法如下：

第一批，ADR注射量为1.5 mg/kg：试验分为空白组(A组)12只，模型组(B组)24只，阳性药组(C组)24只。试验开始后B组、C组腹腔注射ADR 1.5 mg/kg，2次/w，连续9 w，A组同时腹腔注射同体积生理盐水10 ml/kg；C组灌胃芪苈强心胶囊0.33 g/kg，1次/d，连续63 d，A组和B组同时灌胃同体积蒸馏水10 ml/kg。

第二批，ADR注射量为2.0 mg/kg：试验分为空白组(D组)12只，模型组(E组)25只，阳性药组(F组)24只。试验开始后E组、F组腹腔注射ADR 2.0 mg/kg，1次/w，连续13 w，D组同时腹腔注射同体积生理盐水10 ml/kg；C组灌胃芪苈强心胶囊0.33 g/kg，1次/d，连续91 d，D组、E组同时灌胃同体积蒸馏水10 ml/kg。

第三批，ADR注射量为3.0 mg/kg：试验分为空白组(G组)13只，模型组(H组)24只，阳性药组(I组)24只。试验开始后H组、I组腹腔注射ADR 3.0 mg/kg，1次/w，连续8 w，G组同时腹腔注射同体积生理盐水10 ml/kg；I组灌胃芪苈强心胶囊0.33 g/kg，1次/d，连续56 d，G组、H组同时灌胃同体积蒸馏水10 ml/kg。

1.5存活率计算 各组记录初始动物数，试验结束后记录各组存活动物数，计算各组动物的存活率。

1.6心功能检测 末次给药后30 min，各组随机选取10只大鼠，称重，腹腔注射乌来糖(1.2 g/kg、10 ml/kg)麻醉，仰卧固定，右侧颈总动脉插管经压力换能器接生理记录仪，记录心率、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)后，继续将导管插至左心室，记录左心室收缩末期压力(LVESP)、左心室舒张末期压力(LVEDP)、左心室内压最大上升/下降速率(±dp/dt max)。

1.7心脏指数测定 心功能检测结束后，去除腹腔内腹水后再次称重，计算腹水重量=体重-去腹水体重；取心脏，去除非心肌组织，洗净血液，滤纸吸干水分，称全心重量。计算心脏指数(HW/BW)=全心重量/体重。

1.8心肌组织中BNP含量检测 每组随机选取10只大鼠，腹主动脉取血，经3 000 r/min离心15 min，分离血清，-80℃保存备用。ELISA检测血清中BNP的含量。

1.9心肌组织苏木素-伊红(HE)染色观察 每组随机选取若干只大鼠，摘取心脏，称重后，将部分心肌组织固定于10%甲醛溶液中，HE染色，光镜下心肌细胞形态学观察，并测量心室壁厚度。

1.10心肌组织凋亡率检测 各组随机选取8只大鼠，摘取心脏，将部分心肌组织固定于10%甲醛溶液中，进行TUNEL染色，观察心肌细胞凋亡情况，计算凋亡率。

1.11心肌组织中相关蛋白的检测 动物采血后，取部分心肌组织，-80℃保存备用，通过Western印迹分析心肌组织中凋亡信号通路蛋白Caspase3、Bax、Bcl-2表达的变化。

1.12统计学方法 采用SPSS22.0软件统计进行t检验。

2 结 果

2.1ADR致大鼠CHF对存活率的影响 A组存活率为100%(12/12)，D组存活率为91.67%(11/12)，G组存活率为100%(13/13)；C组存活率为62.5%(15/24)，F组存活率为62.5%(15/24)，I组存活率为91.7%(22/24)；B组存活率为70.83%(17/24)，E组存活率为68.00%(17/25)，H组存活率为87.50%(21/24)，即模型组存活率：H组>B组>E组，说明3.0 mg/kg剂量组模型的制备动物存活率较高。

2.2ADR致大鼠CHF对心功能的影响 ADR 1.5 mg/kg组：与A组相比，B组心率、SBP显著下降，-dp/dt max有降低趋势，LVEDP显著升高(P<0.01)，LVESP、+dp/dt max显著降低(P<0.01)；与B组相比，C组心率、SBP、LVESP均显著升高(P<0.01；P<0.05)。

ADR 2.0 mg/kg组：与D组相比，E组SBP和LVESP显著降低(P<0.01；P<0.05)，LVEDP显著升高(P<0.05)，DBP有升高的趋势，±dp/dt max有降低趋势(P>0.05)；与E组相比，F组SBP、DBP、LVESP、±dp/dt max均显著升高(P<0.01，P<0.05)，LVEDP显著降低(P<0.05)。

ADR 3.0 mg/kg组：与G组相比，H组LVESP、±dp/dt max均显著降低(P<0.01；P<0.05)，心率有降低的趋势，DBP和LVEDP有升高的趋势(P>0.05)；与H组相比，I组心率和LVESP显著增加(P<0.05)，±dp/dt max增加(P<0.05)，见表1。

表1 ADR致大鼠CHF对心功能的影响

2.3ADR致大鼠CHF对心脏重量及心脏指数的影响 ADR 1.5 mg/kg组：与A组相比，B组体重和心脏重量均显著降低(P<0.01)，腹水重量和心脏指数有增加的趋势(P>0.05)；与B组相比，C组体重有升高的趋势(P>0.05)。ADR 2.0 mg/kg组：与D组相比，E组体重和心脏重量显著降低(P<0.01)，腹水重量显著增加(P<0.01)；与E组比较，F组大鼠体重有降低的趋势(P>0.05)。ADR 3.0 mg/kg组：与G组相比，H组体重、心脏重量、心脏指数均显著降低(P<0.01；P<0.05)，腹水重量显著增加(P<0.01)；与H组比较，I组大鼠体重、心脏重量及心脏指数均显著增加(P<0.01；P<0.05)，腹水重量显著降低(P<0.01)，见表2。

2.4ADR致大鼠CHF对血清BNP含量的影响 ADR 1.5 mg/kg组：空白组与模型组比较无显著差异(P>0.05)，与模型组比较，阳性药组BNP含量显著降低(P<0.01)。ADR 2.0 mg/kg组：与空白组比较，模型组BNP含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组BNP含量显著降低(P<0.05)。ADR 3.0 mg/kg组：与空白组比较，模型组BNP含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组BNP含量显著降低(P<0.01)，见表3。

表2 ADR致大鼠CHF对心脏指数的影响

表3 ADR致大鼠CHF对血清BNP含量及左心室壁厚度的影响

2.5ADR致大鼠CHF对左心室壁厚度的影响 ADR 1.5 mg/kg组：与空白组比较，模型组左心室壁厚度降低(P<0.05)。ADR 2.0 mg/kg组：与空白组比较，模型组左心室壁厚度显著降低(P<0.01)；ADR 3.0 mg/kg组：与空白组比较，模型组左心室壁厚度显著降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组左心室壁厚度显著增加(P<0.05)，见表3。

2.6ADR致大鼠CHF对心肌组织形态学的影响 HE染色结果显示：ADR 1.5 mg/kg组：A组心肌细胞排列紧密，心肌间质可见轻微水肿、疏松；B组心肌细胞体积变小，左心室壁厚度明显变薄，心肌间质可见水肿；C组大鼠左心室壁变薄，心肌间质疏松区域减少。ADR 2.0 mg/kg组：D组可见局部少量心肌间血管充血；E组左心室壁变薄，心肌间质可见明显水肿、疏松；F组大鼠左心室壁变薄，心肌间质水肿、疏松程度减轻。ADR 3.0 mg/kg组：G组心肌纤维排列规整，细胞核多位于肌纤维中央，心肌间质未见渗出、未见水肿，心肌内血管未见扩张充血，心内膜、外膜亦未见炎细胞浸润；H组心肌细胞变性、水肿；心肌间质间隙扩大；心肌纤维染色不均；左心室壁厚度明显变薄，左心室腔变大；乳头肌处心肌纤维变性明显，呈典型的心肌病改变，心外膜可见炎细胞浸润；I组心肌典型的心肌病改变，心肌细胞变性、水肿；心肌间质间隙扩大；血管扩张，心肌纤维染色不均的程度有所减轻，见图1。

2.7ADR致大鼠CHF对心肌组织凋亡指数的影响 分别与各自空白组比较，ADR 1.5、2.0、3.0 mg/kg模型组心肌细胞凋亡指数均显著升高(P<0.01;P<0.05)；与模型组比较，1.5 mg/kg阳性药组心肌细胞凋亡指数有降低趋势(P>0.05)，2.0、3.0 mg/kg阳性药组心肌细胞凋亡指数显著降低(P<0.05)。

TUNEL染色显示，ADR 1.5 mg/kg组：A组凋亡细胞数较少，凋亡阳性细胞呈深棕色；B组深棕色凋亡阳性细胞散在分布在未凋亡的心肌细胞间；C组可见极少见的呈深棕黄色阳性染色的细胞分布在正常心肌细胞间，观察视野内凋亡阳性染色细胞数量极少；ADR 2.0 mg/kg组：D组散在分布的深棕色凋亡阳性细胞数较少；E组可观察到视野内呈深棕色凋亡阳性细胞分布增加；F组可见数个呈深棕黄色阳性染色的细胞分布，观察视野内凋亡阳性染色细胞数量减少；ADR 3.0 mg/kg组：G组可见极少见的呈深棕黄色阳性染色的细胞分布在正常心肌细胞间，观察视野内凋亡阳性染色细胞数量极少；H组可见数个呈深棕黄色阳性染色的细胞分布，观察视野内凋亡阳性染色细胞数量增加；I组可见数个呈深棕黄色阳性染色的细胞分布，观察视野内凋亡阳性染色细胞数量减少，见表4、图2。

表4 ADR致大鼠CHF对心肌组织细胞凋亡指数的影响

图2 阿霉素致大鼠CHF对心肌组织凋亡的影响(TUNEL染色，×200)

2.8ADR致大鼠CHF对心肌组织凋亡相关蛋白表达的影响 ADR 1.5 mg/kg组，与A组比较，B组Bcl-2显著降低，Bax、Caspase-3显著升高(均P<0.05)；与B组比较，C组Bcl-2组显著升高(P<0.01)，Bax显著降低(P<0.05)。ADR 2.0 mg/kg组，与D组比较，E组Bcl-2显著降低，Bax、Caspase-3显著升高(均P<0.01)；与E组比较，F组Bcl-2显著升高(P<0.01)，Bax显著降低(P<0.05)。ADR 3.0 mg/kg组，与G组比较，H组Bax、Caspase-3显著升高，Bcl-2显著降低(均P<0.05)；与H组比较，I组Bcl-2显著升高(P<0.01)，Bax显著降低(P<0.05)，Caspase-3有降低趋势(P>0.05)，见图3、表5。

与空白组相比：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组相比：3)P<0.05，4)P<0.01图3 ADR致大鼠CHF对心肌组织凋亡相关蛋白表达的影响

表5 ADR致大鼠CHF对心肌组织凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨 论

CHF是指由各种致病因素导致的心脏结构和功能发生异常，表现为心脏负荷过重，心肌舒缩力下降，导致心排血量不足，引起一系列临床症状和体征的复杂综合征〔5～7〕。研究显示，心室重构是CHF发生的基本机制。心室重构是由于心肌容量或压力负荷过重或心肌损伤，使心肌结构和功能发生改变，从而直接导致心肌收缩和舒张功能减退、心肌纤维化及心肌细胞凋亡等一系列病理生理变化〔8〕。ADR与心肌具有较强的亲和性，可直接损伤心脏的结构和功能，累计用药可诱发心肌细胞坏死、凋亡等，导致心室重构，严重时诱发CHF〔9～11〕。

研究表明，CHF发生的基本机制是心脏收缩和舒张功能下降，±dp/dt max是反映心肌收缩和舒张的最大速度，+dp/dt max主要受心率及前后负荷的影响，反映左心室的收缩功能，当心肌的收缩能力下降时，+dp/dt max值也下降；-dp/dt max反映心肌舒张时心肌纤维收缩成分延长的最大速率，反映左心室的舒张功能，当心肌的舒张能力下降时，-dp/dt max值也下降〔12，13〕。LVESP是反映左心室内压上升时达到的最大值，LVEDP反映舒张末期的左心室内压，心力衰竭时由于心脏收缩性减弱，LVESP降低；由于舒张功能障碍，心室顺应性降低，导致左心室舒张末期容积扩大，LVEDP升高。因此，常用LVESP、LVEDP和±dp/dt max作为评价心肌舒缩功能的重要指标。

BNP是在心室容积扩张和压力负荷增加时，由心肌细胞合成并从心室释放的一种神经激素。研究表明，心力衰竭时BNP分泌迅速增加，从而延缓心脏前负荷的增加；也可通过充盈心室减轻体液负荷和静脉充血，进一步调节心功能障碍。由于BNP分泌增加是在心功能障碍时突发的，不受其他因素干扰，因此由血浆BNP水平反映心功能状态更具代表性，常作为评价心力衰竭的金指标〔14，15〕。

心力衰竭导致心室重构，心肌细胞大量丢失，细胞凋亡是心室重构致心肌细胞丢失表达的主要形式。心力衰竭时神经内分泌系统激活，分泌物质可诱导心肌细胞凋亡，心肌细胞减少，导致心肌收缩力下降，心功能发生障碍，进一步加重心力衰竭〔16～18〕。心力衰竭时由于心脏负荷加重，心室内压力增大导致心肌细胞舒张变细，心室壁变薄；心肌细胞凋亡使细胞数量减少，可进一步促进心室壁变薄。心力衰竭时，由胶原、纤维黏连蛋白等组成的心肌细胞外基质被破坏，出现心肌纤维化〔19，20〕。

综上，ADR诱导CHF可导致心室重构，心脏舒缩功能下降，心重指数下降，BNP含量升高，左心室壁变薄，出现明显的心肌纤维化改变及心肌细胞凋亡。3.0 mg/kg ADR诱导CHF模型组各项指标检测结果较1.5 mg/kg、2.0 mg/kg模型组结果更为显著，并且造模周期短，动物存活率较高。因此，采用腹腔注射ADR 3.0 mg/kg，1次/w，连续8 w的方法制备大鼠CHF动物模型较理想。