肺鳞癌患者死亡相关蛋白激酶表达及其启动子甲基化水平的诊疗意义

石珊珊 刘丽洁 张秀娣 王晓杰 刘楠楠 尹小波 田祺 徐淑凤

(秦皇岛市第一医院，河北 秦皇岛 066000)

随着城市大气污染逐渐加重及其他各类致癌物质不断增加，肺鳞状细胞癌的发病率也随之升高〔1〕。死亡相关蛋白激酶(DAPK)是人体细胞中存在的抑癌因子之一，参与调节人类细胞的内源性及外源性的凋亡途径，DAPK基因启动子甲基化与多种恶性肿瘤的发生、发展有密切关系〔2〕。研究结果表明，4%的组织特异性基因和所有的管家基因的5′端调控区都存在一个胞嘧啶磷酸鸟嘌呤(CpG)高频区，称为CpG岛〔3〕。依据肺癌所具有的病理组织学特点可将其划分为两大类型即小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)，在临床中80%～85%的肺癌患者的病理类型是NSCLC。目前研究遗传学机制在NSCLC发生发展中的作用日益受到重视，尤其是T-钙黏蛋白(CDH13)基因启动子区的高甲基化状态与该基因转录过程受抑制失活在肺癌发生发展中的作用机制〔4〕。抑癌基因的5′端CpG岛甲基化在NSCLC发生、发展的过程中发生比较频繁，并且这种异常的甲基化状态在肺癌发生的早期就能被检测到。研究结果显示，基因启动子的CpG岛发生甲基化改变是引起基因失活特别是抑癌基因失活的关键因素之一，因此启动子甲基化改变在NSCLC发生发展过程中所发挥的作用也引起了广泛的关注〔5〕。本研究探讨吸烟肺鳞癌患者痰液及血清中DAPK表达及启动子甲基化在临床诊疗中的意义。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取秦皇岛第一医院的肺鳞癌患者60例为实验组，平均年龄(61.0±5.1)岁，同期健康人群34例为对照组，并均排除家族恶性肿瘤史，其中男20例，女14例，平均年龄(60.0±1.2)岁。两组均留取其痰液及血清标本。两组性别、年龄等一般资料无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要仪器及试剂 低温离心机(美国Beckman公司)，恒温水箱(上海启前公司)，水平凝胶电泳系统(英国Cleayer公司)，紫外分光光度计(上海光谱公司)，聚合酶链反应(PCR)扩增仪(北京东胜)，紫外荧光数字成像仪(德国孚光公司)，电子分析天平(日本岛津公司)。兔抗人DAPK多克隆抗体(武汉博士德公司)，兔抗人血管内皮生长因子(VEGF)多克隆抗体(北京中杉金桥)，2×Taq PCR MasterMix试剂盒(南京赛泓瑞公司)。采用引物为上海生工生物工程技术服务有限公司完成，β-actin上游：5′-GGGACCTGACTGACCTCA-3′，下游：5′-GGTGGAATCCC TCCGACA-3′;DAPK上游：5′-GGATATGGGATTTTTGTGTAGATTAGTA-3′，下游：5′-ACCAAAATAATCTCCATCTCTTAAC-3′。

1.3痰液和血清脱氧核糖核酸(DNA)提取及甲基化检测 试剂盒提取血清中DNA，血清中DNA甲基化检测参照Hennan方法(MSP)。β-actin作为空白对照，健康人群DNA作为未甲基化分析的对照组。痰液留取及启动子甲基化检测，患者入院后留取清晨口腔清洁后深咳痰液，置于Saccomanno液中，放置3 d。痰液中DNA的提取方法：4 000 r/min 4℃离心15 min后，将沉淀用DNA提取液〔10 mmol/L Tris·HCl；0.1 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，20 μg/ml核糖核酸(RNA)酶，0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)〕移入1.5 ml离心管，混匀后37℃水浴1 h。以后步骤同血清标本DNA提取及甲基化检测。对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶(内含EB)电泳(120 V，30 min)，内参照为β-actin。应用紫外线透视仪对相应扩增条带进行光密度值(IOD)测定。

1.4血清及痰液免疫组化 将采集后的血液及痰液进行标本处理，按常规免疫组化步骤行染色处理，DAPK表达以细胞质出现棕褐色颗粒为阳性表达，随机选取5个高倍视野(×400)，①按照高倍视野下所见组织着色程度(A值)进行评分：无着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。②按照高倍视野下所见阳性细胞百分率(B值)进行评分：阳性细胞小于25%为1分，阳性细胞在25%～50%之间为2分，阳性细胞>50%为3分；③将A值、B值相加对结果进行判断：阴性(-)：0分，弱阳性(+)：1～3分，强阳性()：4～6分。

1.5统计学方法 采用SPSS19.0软件进行χ2检验。

2 结 果

2.1两组痰液及血清中DAPK蛋白表达 实验组痰液〔50.00%(+8例、15例、7例)〕及血清中DAPK蛋白表达阳性率〔60.00%(+8例、20例、8例〕均显著低于对照组〔91.18%(+4例、9例、8例)；91.18%(+2例、25例、48例)，χ2=16.151,10.303;均P<0.05〕。

2.2两组痰液及血清中DAPK启动子甲基化率 实验组痰液及血清中DAPK启动子甲基化率〔37例(61.67%)、40例(66.67%)〕均显著高于对照组〔0例(0.00%)、0例(0.00%)，均P<0.05〕。

2.3DAPK 在肺鳞癌患者痰液及血清中的表达 DAPK在痰液和血清中表达量与年龄、性别、肿瘤大小及肿瘤分化程度无关(P>0.05)，与肿瘤浸润及淋巴结转移有关(P<0.05)，见表1。

表1 DAPK 在肺鳞癌患者痰液及血清中的表达〔n(%)〕

3 讨 论

多项研究结果表明，基因启动子区域CpG岛异常甲基化的发生和基因转录抑制失活紧密相关。在多种恶性肿瘤发生的早期过程中，基因启动子异常甲基化是一个频繁发作的事件，因此研究者考虑它可作为一种有实际应用可能的肿瘤分子生物标志物〔6〕。近年来，研究者不断地深入研究DNA 甲基化及其在肿瘤发生发展中的作用机制。基因组通常含有两类遗传信息：由DNA序列提供的遗传信息及提供了基因表达模式的表观遗传学信息。表观遗传信息主要的作用机制是DNA甲基化和(或)组蛋白乙酰化〔7〕。在表观遗传学中，研究最广泛、最深入的领域就是DNA甲基化。在绝大多数的真核生物遗传物质中，DNA甲基化过程被认为只会发生在胞嘧啶的第五位碳原子上，S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)为DNA甲基化过程提供甲基(-CH3)，经过DNA甲基转移酶(DNMT)催化后，SAM的甲基被转移到胞嘧啶的第五位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)〔8〕。有研究表明人类基因启动子区约60%都含有CpG岛，一旦CpG岛发生甲基化，相应的染色体结构便会发生如高度螺旋、凝缩成团、失去转录活性等变化，使基因不能正常表达。DNA甲基化可使染色体结构修饰、基因组印迹、染色体失活等过程受到影响〔9〕。目前多种恶性肿瘤细胞对化疗药物的不敏感甚至产生耐药的现象已经成为恶性肿瘤化疗过程的一大障碍。化疗药物使恶性肿瘤细胞发生反应的过程离不开DNA修复基因的调节作用，若修复基因的基因启动子区发生DNA甲基化，将会导致基因不能正常转录从而引起基因沉默最终使修复基因不能正常表达〔10〕。在恶性肿瘤组织细胞中，可通过调节与DNA修复过程相关基因的启动子区的甲基化状态，最终诱导肿瘤组织细胞获得对化疗药物固有性耐药的特性；且化疗药物本身就能刺激肿瘤细胞的药敏基因，引起药敏基因DNA甲基化状态的变化，从而诱导恶性肿瘤细胞获得性耐药特性的产生。

研究者还发现DNA甲基化具有可逆性特征，存在耐药性基因的甲基化状态发生变化进而影响肿瘤细胞对化疗药物敏感性发生变化的可能〔11〕。如DNA修复相关基因O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)。MGMT是一种可逆转由烷化剂引起的DNA损伤的DNA修复酶。故其在肿瘤细胞中表达升高可降低肿瘤细胞对烷化剂类化疗药物作用的敏感性，这是恶性肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性的分子基础。在恶性肿瘤细胞和组织中，DNA甲基化转移酶介导的MGMT启动子区甲基化状态改变是导致其活性降低的主要因素〔12〕。MGMT启动子CpG岛的甲基化使转录不能正常进行，进而影响该基因正常表达而发挥作用，最终导致基因沉默。研究者已在神经胶质瘤中对这种机制进行了大量研究〔13〕。MGMT基因启动子的高甲基化状态和恶性肿瘤组织细胞对烷化剂类药物敏感性升高紧密相关，但MGMT甲基化水平与恶性肿瘤细胞对化疗药物敏感性之间并无明显的相关性。冷曙光〔14〕对26株恶性黑色素瘤细胞系进行研究时发现，不同细胞系之间对替莫唑胺的敏感性并不相同，MGMT的活性和表达水平与恶性肿瘤细胞对替莫唑胺敏感性呈现出明显的负相关关系；但对细胞系进行基因甲基化状态的检测结果显示，在26株细胞系中，11株细胞系基因并没有发生启动子区甲基化，15株细胞系基因既有启动子区甲基化又有未甲基化存在。提示MGMT基因启动子区的甲基化水平与恶性肿瘤细胞对替莫唑胺敏感性并没有显著的相关性，表明在部分肿瘤细胞中，DNA甲基化改变并不是唯一能够调节MGMT表达或活性的因素，也许存在其他影响因素，如单核苷酸多态性等可能也参与了MGMT的活性和表达，但具体机制仍需更深入研究与探讨。

DAPK基因位于人类第9号常染色体q34.1上，其参与编码翻译的蛋白质是一种依赖于钙离子/钙调蛋白调节、相对分子质量为16×104的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它是一种参与细胞凋亡调节的正调控因子。在人体的正常组织中，DAPK基因可通过多条途径参与细胞凋亡，研究证实，DAPK可通过依赖P19arf方式激活p53从而诱导细胞凋亡的发生；DAPK还可通过上调凋亡相关因子Bcl-2相关x蛋白(Bax)、p53上调凋亡调控因子(PUMA)、成人T淋巴细胞白血病PMA反应基因(Noxa)和凋亡酶激活因子(Apaf)-1等触发线粒体凋亡途径的发生。在缺乏p53的细胞中，DAPK也可触发Ⅱ型自噬性细胞的死亡〔15〕。表明DAPK对启动生命体细胞正常程序性死亡过程的发生起着重要作用。多项研究提示〔16〕，DAPK基因不正常表达主要因其基因上游启动子区CpG岛发生异常甲基化改变，抑制DAPK的基因转录为mRNA的过程，阻碍正常编码死亡相关蛋白激酶，使死亡相关蛋白激酶的表达比正常水平降低，导致DAPK蛋白对细胞凋亡的调控失去控制，凋亡机制受到影响，引起细胞肿瘤化，DAPK对肿瘤的发生、发展及转移有着重要联系。华海蓉等〔17〕在对云锡矿工肺癌组织DAPK基因的蛋白表达及其甲基化异常现象研究时发现，矿工肺癌组织中缺少或缺乏DAPK基因的表达，表明DAPK基因异常甲基化改变可能参与了肺癌的发生发展。本研究表明，DAPK在肺癌患者中的痰液及血清中的表达均有所降低，其表达与肿瘤细胞的浸润及淋巴结转移有关。研究结果还表明，肺鳞癌患者痰液和血清中DAPK基因启动子甲基化改变较良性肺部疾病患者升高，对初步区分肿良恶性有一定的意义。