曾娅莉,李明珍,蒲 琴,蒋正方,周 云,邓建军,蒋 奕,张 旭,杨 洁,陈孝刚,马 骥
四川绵阳四0四医院检验科,绵阳四川 621000
提高新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者的检出率,积极检出感染者,隔离传染源,切断传播途径是其最重要的防治措施[1-2]。 根据诊疗方案,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸水平是COVID-19的实验室确诊方法,也用于判断COVID-19患者是否可以出院。qRT-PCR技术被广泛地应用,但其结果受标本影响大,其对COVID-19的检出率不够理想,给COVID-19的诊治带来很大困扰。SARS-CoV-2 IgM抗体是《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中的一般实验室血清学检测项目,它检出率高,所测标本为血液,容易采集,技术要求比qRT-PCR低,目前已在临床推广并使用。本课题组连续3 d采集本院收治的15例确诊COVID-19患者的血液、晨痰、咽拭子、唾液及晨尿5种标本;qRT-PCR检测上述5种标本的SARS-CoV-2核酸水平;同时连续3 d检测患者血浆SARS-CoV-2 IgM抗体;然后对以上试验结果进行了分析,旨在提高COVID-19的检出率,减少漏诊或误诊。
1.1一般资料 将于本院治疗的确诊COVID-19患者15例纳入研究作为患者组,诊断标准为《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》[3]。患者1号是危重性, 2号是重型,3~15号为普通型,住院时间1~15 d。另外,将排除其他疾病的体检健康者15例纳入研究作为对照组。
1.2仪器与试剂 EXDAN/RNA核酸提取试剂购自苏州天隆生物科技有限公司;qRT-PCR法检测SARS-CoV-2核酸的试剂盒有两种,分别为上海之江生物科技股份有限公司的产品(以下简称之江试剂)和圣湘生物科技股份有限公司的产品(以下简称圣湘试剂);胶体金法检测SARS-CoV-2 IgM抗体的试剂盒为珠海丽珠试剂股份有限公司产品。采用的实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司的ABI7500Fast型和上海宏石医疗科技有限公司的SLAN-96P型。用天隆PANA9600S全自动核酸工作站(西安天隆科技有限公司产品)进行核酸提取操作。
1.3方法
1.3.1标本的采集 连续3 d,每天早晨7:00-8:00采集5种标本。血液标本:取患者空腹全血2~3 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管。 痰液标本:患者漱口后取晨痰于灭菌杯。 咽拭子标本:无菌拭子在患者双咽侧扁桃体及咽后壁擦拭3次,然后留取标本于病毒保存管。 尿液标本:取患者晨尿10 mL于一次性尿液采样管。 唾液标本:患者晨起漱口,翘舌,取1~2 mL唾液于灭菌杯。以上标本均在2 h内送检。
1.3.2qRT-PCR法测SARS-CoV-2核酸水平 (1)试剂准备:严格按照试剂盒说明书进行操作。(2)标本前处理:血浆,4 000 r/min离心10 min,分离血浆备用;痰液,56 ℃灭活40 min,加入1∶1或1∶2的病毒保存液,充分振荡直至呈液滴状,取上述液体500 μL, 3 500 r/min离心3 min,留取上清液备用;咽拭子,56 ℃灭活40 min,充分振荡混匀后,吸取800 μL标本,12 000 r/min离心5 min,去除上清液500 μL,振荡混匀下层液体备用;尿液,取5 mL,56 ℃灭活40 min,4 000 r/min离心5 min,去除上清液,留取下层尿液300 μL,加入1 mL生理盐水混匀,12 000 r/min离心5 min,去除上清液,留取下层液体约300 μL备用;唾液,56 ℃灭活40 min,加入1∶1的病毒保存液,充分振荡直至呈液滴状备用。(3)提取核酸:吸取上述处理好的标本300 μL于1.5 mL离心管中,用天隆PANA9600S全自动核酸工作站提取核酸。(4)加样:圣湘试剂,吸取20 μL待测核酸加入30 μL PCR-混合液的扩增管中,盖上管盖,振荡混匀,瞬时离心,准备上机扩增;之江试剂,吸取5 μL核酸加入20 μL PCR-混合液的扩增管中,盖上管盖,振荡混匀,瞬时离心,准备上机扩增。(5)PCR扩增:按圣湘试剂说明书设置扩增条件,选择VIC 通道检测内标物,选择FAM通道检测ORF-1ab阅读框,ROX通道检测N基因;50 ℃ 30 min,95 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,循环数45;25 ℃ 10 s;运行反应。按之江试剂说明书设置扩增条件,选择CY5通道检测内标物,选择FAM通道检测ORF-1ab阅读框,VIC通道检测N基因,TEXAS RED通道检测E基因;45 ℃ 10 min,95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,循环数45;40 ℃,10 s;运行反应。(6)结果判断:圣湘试剂,FAM 和ROX通道检测到典型的S型扩增曲线且Ct≤40的标本为SARS-CoV-2阳性, Ct>40的标本为SARS-CoV-2阴性;上海之江试剂,FAM、VIC、TEXAS RED通道检测到典型的S型扩增曲线且Ct≤43的标本为SARS-CoV-2阳性,Ct>43或无数值的标本为SARS-CoV-2阴性。若患者某一种标本的核酸检测阳性次数≥1,则判定该患者可被这种标本的SARS-CoV-2核酸检测检出。某一种标本的核酸阳性检出率=该标本的核酸阳性例数/确诊COVID-19患者例数×100%。
1.3.3胶体金法检测血浆SARS-CoV-2 IgM抗体 平衡试剂盒至室温,采集2~3 mL全血于EDTA抗凝试管,4 000 r/min,离心10 min,分离血浆。生物安全柜内取血浆10 μL滴于加样孔,滴加2~3滴标本稀释液,室温放置15 min,肉眼观察结果。质控线和检测线同时出现即可判为结果阳性;仅出现一条质控线,不出现检测线,则结果为阴性。患者血清IgM抗体检测结果≥1次阳性,判定该患者SARS-CoV-2 IgM抗体阳性。IgM抗体阳性检出率=IgM抗体阳性例数/确诊COVID-19患者例数×100%。
1.4统计学处理 使用Excel和SPSS23.0软件进行计算和统计分析,计数资料以频数或百分率表示,组间比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1患者1次检测5种标本的SARS-CoV-2核酸阳性检出率 1次检测5种标本对患者SARS-CoV-2核酸的阳性检出率:痰46.66%,咽拭子40.00%,血液13.33%,唾液33.33%,晨尿0,除晨尿外COVID-19患者的痰、咽拭子、唾液和血液标本均可检出SARS-CoV-2核酸,痰标本的阳性检出率最高,血液标本最低。1次采集1号重型和2号危重型患者的5种标本的SARS-CoV-2核酸阳性检出率均为80.00%,普通型患者为20.00%或0,见表1。危重型或重型患者标本的SARS-CoV-2核酸阳性检出率高于普通型患者(P<0.05)。
表1 1次采集15例COVID-19患者的5种标本的SARS-CoV-2核酸检测情况
2.2患者1次检测SARS-CoV-2 IgM抗体的阳性率 对照组血浆SARS-CoV-2 IgM抗体的阳性率为0,患者组阳性率为93.33%,两组间阳性率比较差异有统计学意义(P<0.01),见表2。
表2 两组人群1次检测血浆SARS-CoV-2 IgM抗体的结果[n(%),n=15]
2.3连续3次检测的阳性检出率 连续3次(每天1次)采集5种标本进行SARS-CoV-2核酸检测,各标本的SARS-CoV-2核酸阳性检出率:痰80.00%,咽拭子66.66%,血液13.33%,唾液60.00%,晨尿0。痰、咽拭子和唾液的SARS-CoV-2核酸阳性检出率均较1次检测提高。连续3次与1次检测确诊患者的血浆SARS-CoV-2 IgM抗体阳性率相同,除9号患者外,其余患者均检测出IgM抗体,阳性率93.33%(14/15),见表3。SARS-CoV-2 IgM抗体阳性检出率高于SARS-CoV-2核酸阳性检出率(P<0.05)。9号患者SARS-CoV-2 IgM抗体呈阴性,但该患者痰标本SARS-CoV-2核酸阳性。若SARS-CoV-2核酸与IgM检测联合,多次多部分采集SARS-CoV-2核酸标本,15例COVID-19患者的检出率为100.00%,高于两种方法单独使用(P<0.05)。
表3 COVID-19患者连续3次检测IgM抗体和5种标本SARS-CoV-2核酸的情况
COVID-19的实验室特异性检测方法主要有两种,一种是SARS-CoV-2核酸检测,另一种是SARS-CoV-2 IgM抗体检测[5]。核酸检测具有特异性强、灵敏度高,感染早期即可检出,无窗口期等优点[6], 因此核酸结果对COVID-19的诊断和疗效判断至关重要[4-5]。但SARS-CoV-2核酸检测结果受标本采集影响大,容易出现假阴性,而且目前实验室对检测标本的类型要求不统一,有痰、咽拭子、鼻咽拭子、粪便或血液等标本类型,标本类型对核酸检测结果的影响尚不清楚。SARS-CoV-2 IgM抗体是SARS-CoV-2感染的早期指标,当患者感染SARS-CoV-2的 3~5 d后可出现IgM抗体[7]。SARS-CoV-2 IgM抗体检测的优点是方便、快捷,标本容易采集,结果相对稳定,阳性率高,但IgM抗体产生有窗口期,易受其他免疫性疾病的干扰。本研究选取了15例确诊COVID-19患者,同时采集了患者的5种标本,1次和连续3次检测患者的SARS-CoV-2核酸、SARS-CoV-2 IgM抗体,分析了不同标本、检测次数对核酸检测结果的影响,比较了两种方法对COVID-19患者的检出效果,探讨了提高COVID-19实验室检出率的方法。
本研究中,1次检测患者5种标本SARS-CoV-2核酸的检出率均小于50%。患者5种标本的SARS-CoV-2核酸检测阳性检出率由高到低依次为痰、咽拭子、唾液、血浆、晨尿,其中痰标本的阳性检出率最高。因此,如果没有肺泡灌洗液,COVID-19患者核酸检测标本应优先选用深部痰液,这与COVID-19相关诊疗方案推荐的核酸检测标本一致[7-8]。15例COVID-19患者中,仅危重型与重型患者的血浆标本检出SARS-CoV-2核酸,普通型患者的血液标本未检出,可见血液标本用于核酸检测仅适用于重型或危重型患者。另外,本研究检测到患者唾液标本SARS-CoV-2核酸阳性,说明SARS-CoV-2可通过飞沫进行传播。
SARS-CoV-2IgM抗体检测的阳性率高,特异性强,但IgM抗体是疾病感染的早期指标,有窗口期,在体内时间短,容易消失,容易被其他免疫性疾病干扰[9-11]。本研究仅1例患者未检出SARS-CoV-2IgM抗体,经调查该患者为发病时间2d的老年患者。本研究的15例COVID-19患者的SARS-CoV-2IgM抗体阳性检出率高达93.33%,明显高于SARS-CoV-2核酸的阳性检出率。连续3次检测患者SARS-CoV-2IgM抗体阳性率无变化,结果稳定。若只以SARS-CoV-2IgM抗体作为COVID-19的筛查指标,会发生漏检的风险,或因其他免疫疾病的干扰而出现假阳性。连续3次取患者5种标本检测SARS-CoV-2核酸,痰、咽拭子和唾液标本的阳性检出率明显提高,但仍有漏检的情况。本研究中,连续3次采集5种标本检测SARS-CoV-2核酸的同时检测患者血浆SARS-CoV-2IgM抗体,对COVID-19患者的检出率能达到100.00%。因此,多次多部位采集标本,两种方法联合检测用于COVID-19诊断的效果最佳。
综上所述,如无法采集肺部灌洗液,检测SARS-CoV-2核酸的最佳标本为患者深部的痰液,咽拭子和唾液标本作为补充,血液标本仅适用于重型或危重型患者。多次多部位采样患者标本进行SARS-CoV-2核酸检测,联合SARS-CoV-2 IgM抗体检测,可大大降低COVID-19患者漏检率。