云南哈尼族验方“魔呐奇”抑制缺血半影区神经元自噬流诱导卒中后神经保护研究

张雪玉，邓仪昊，郭 涛，臧 瑞，武煜明，蔡恩丽

(1. 云南中医药大学，云南 昆明 650000；2. 昆明理工大学，云南 昆明 650000)

缺血性脑卒中是危害人类生命健康的一大疾患。目前，全球卒中患者超过8 000万，而缺血性脑卒中患者占比高达80%以上[1]。现代医学血管内介入诊疗虽能恢复血流，但再灌注后的级联反应难以控制，往往造成比缺血阶段更为严重的缺血再灌注损伤[2]，且有严格的时间窗限制，临床应用严重受限[3]。早在1995年，Nitatori等[4]就在脑缺血模型中检测到了细胞自噬并伴有溶酶体活性增强，说明自噬及溶酶体功能是脑缺血疾病发生发展的重要风险因子。自噬作为溶酶体依赖的严格调控分解过程[5]，与清除异常蛋白质聚集体及受损细胞器[6]，抵抗轴突结构和功能变性[7-8]，维持神经系统稳态密切相关。自噬流是近年来提出的新概念，既往研究大多通过检测自噬体数量来评价自噬，但单纯观察自噬体的激活或抑制并不能完整动态地反映自噬在脑缺血过程中的变化[9]。自噬流不仅检测自噬体数量，还需动态监测自噬底物来证实底物是否到达溶酶体，以及自噬水平与自噬底物降解率的变化[10]，故研究缺血半影区神经元自噬流对于进一步揭示缺血性脑卒中的发病机制及寻找新的治疗靶点具有重要意义。“魔呐奇”是云南哈尼族广为流传、应用比较成熟的卒中验方，本课题组前期研究已证实“魔呐奇”可诱导大鼠脑内脑源性神经营养因子(BDNF)的表达，改善大鼠卒中后神经功能，减轻炎症反应，对脑卒中后的脑组织及神经元形态结构发挥着重要保护作用[11]。在此基础上，本实验通过建立大脑中动脉梗死模型，进一步观察“魔呐奇”对大鼠脑缺血损伤后神经保护作用及其与细胞自噬流的关系。

1 实验材料与方法

1.1动物 SPF级雄性SD大鼠54只，体重200～230 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0004。适应性喂养1周，自由饮食。

1.2药物 “魔呐奇”制备：天红地绿15 g、老虎刺皮15 g、满山香15 g、黑皮跌打15 g、山皮条9 g、大荃麻9 g、藤蕉9 g、松节9 g、杨梅皮9 g，上述中药饮片购自云南墨江县委党校医务室。用蒸馏水漂洗干净，磨成粗粉，辅以1 000 mL黄酒，制成生药浓度约为1.2 g/mL的酒剂，用0.45 μm孔径混合膜过滤除菌，无菌装瓶，4 ℃冷藏备用。

1.3试剂及仪器 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)、Beclin-1兔多抗、Ubiquitin鼠单抗、P62兔多抗、Beta-联蛋白、HRP标记的羊抗鼠、HRP标记的羊抗兔、DAPI均购自Cell Signaling Technology公司；RIPA组织/细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司； LC3B兔多抗 (Sigma)，CathepsinB鼠单抗(SANTA CRUZ)，LAMP1兔多抗(ABclonal) 。电泳仪及转膜仪(上海天能科技有限公司)；脱色摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；冰冻切片机(德国莱卡公司)；荧光显微镜(日本尼康公司)。

1.4实验方法 将54只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、魔呐奇组，每组18只。除假手术组(仅分离各血管，不插入栓线，逐层缝合皮肤)外，其余各组均参照改良Longa线栓法[12]制备大鼠左侧大脑中动脉梗死模型，大鼠自然苏醒后，Longa 5分法[12]评分为1～3分的大鼠为造模成功，进行后续实验。造模24 h后，魔呐奇组大鼠按2.5 mL/kg的剂量腹腔注射“魔呐奇”(根据70 kg成人与动物体重药量折算表及给药方式生物利用度换算)，模型组大鼠腹腔注射等量生理盐水，均每天1次，持续腹腔注射14 d。

1.5观察指标及方法

1.5.1神经功能缺损评分及脑梗死体积 注射14 d后，于断颈处死前对大鼠进行改良神经缺损评分(mNSS)，分别包括运动测试、置地测试、感觉测试、平衡木测试、反射缺失以及有无异常运动测试[13]。mNSS评分后，按照TTC染色检测方法进行操作，通过Image J分析软件测定正常侧和梗死侧脑组织体积，然后计算脑梗死区域百分比[(左侧大脑梗死白色区域体积/右侧大脑总体积)×100%]。

1.5.2皮质缺血半影区自噬相关蛋白表达水平 按照 Western blot 检测方法进行操作，其中一抗浓度:Beclin1 1∶500,LC3 1∶12 000,P62 1∶1 000,Ub 1∶1 000,LAMP1 1∶1 000,CathepsinB 1∶1 000 ，以Beta-actin 1∶1 000为内参。采用ImageJ 软件测量条带灰度值，自噬相关蛋白表达水平以目的蛋白/内参的比值表示。

1.5.3皮质缺血半影区LC3阳性表达情况 按照免疫荧光双标检测方法进行操作，其中LC3兔多克隆一抗及Neun鼠多克隆一抗浓度为1∶400，羊抗鼠和羊抗兔荧光二抗浓度为1∶800，于显微镜下调至高倍镜视野(×400)，观察皮质缺血半影区组织细胞形态并拍照，采用Image J软件计算LC3阳性细胞占比。

2 结 果

2.1各组大鼠神经功能mNSS评分比较 模型组大鼠mNSS评分为(5.16±0.98)分，魔呐奇组mNSS评分为(2.67±0.52)分，魔呐奇组明显低于模型组(P<0.05)。

2.2各组大鼠脑梗死体积比较 模型组大鼠梗死脑组织占比为(23.87±3.78)%，魔呐奇组梗死脑组织占比为(18.35±1.75)%，魔呐奇组明显低于模型组(P<0.05)。

2.3各组大鼠缺血半影区自噬流相关蛋白表达水平比较 模型组大鼠缺血半影区Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62(Insouble)、Ubiquitin、CathepsinB、 LAMP1蛋白表达水平均明显高于假手术组(P均<0.05)，P62(Souble)蛋白表达水平明显低于假手术组(P<0.05)；魔呐奇组大鼠缺血半影区Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62(Insouble)、Ubiquitin、CathepsinB、LAMP1蛋白表达水平均明显低于模型组(P均<0.05)，P62(Souble)蛋白表达水平与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1及图2。

图1 Western blot检测自噬相关蛋白表达水平的代表性条带

图2 各组大鼠缺血半影区自噬流相关蛋白表达情况

2.4各组大鼠缺血半影区LC3阳性神经元表达情况 显微镜下观察到假手术组大鼠脑皮质内偶见神经元LC3表达，阳性表达占比为(17.09±2.33)%；模型组大鼠脑皮质缺血半影区内可见大量点状LC3分布于神经元细胞，阳性表达占比为(30.35±3.2)%；魔呐奇组大鼠脑皮质缺血半影区内LC3阳性神经元数量较少，阳性表达占比为(24.81±4.31)%。模型组LC3阳性表达率明显高于假手术组(P<0.05)，魔呐奇组明显低于模型组(P<0.05)。见图3。

图3 各组大鼠缺血半影区LC3阳性神经元表达情况

3 讨 论

缺血性脑卒中归属于中医“中风”范畴，中风多发生于老年人，病机特点为元气不足，瘀血阻络[14]，其中气虚血瘀为中风病机关键，治宜益气活血化瘀[15]。“魔呐奇”在哈尼语中意译为“中风、风湿麻木药”，全方活血兼止血、行气，能起到气顺血行、开闭通腑的作用，对气滞痰凝、经络痹阻导致的卒中后半身不遂、肢体痿弱不用有良好疗效[16]，辅以黄酒，入血分，能温运血脉，以助药势，达到补气活血之功。

在脑缺血早期，激活自噬可加速变性蛋白的清除，挽救大脑残存的神经元功能[17]。随着脑缺血发展，蛋白质聚积物越来越多，自噬溶酶体活性不足，最终自噬的过度激活、不足或缺陷均可加速细胞死亡进程[18-19]。由此可见，在脑缺血晚期，通过调控自噬预防和治疗疾病的关键是维持自噬稳态，保证自噬流的通畅。Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、P62(Souble)蛋白水平可反映自噬活性的强弱。Beclin-1是自噬启动的关键蛋白，参与自噬隔离膜的形成，隔离膜通过LC3与P62相互作用被吸收到隔离体中，自噬体生长在隔离体表面[20]，LC3亚型LC3Ⅱ和可溶性P62(Souble)可作为自噬体的标记蛋白[21]。自噬底物募集蛋白P62有可溶性和不可溶性之分[22]，细胞发生自噬时，自噬体通过细胞骨架微管系统将其包裹物运输至溶酶体，自噬底物募集蛋白P62将破损蛋白及大分子物质经过泛素化蛋白Ubiquitin修饰后与LC3Ⅱ一同运送至溶酶体途径降解[23]，溶酶体降解率受体内酸性水解酶 CathepsinsB影响[24]，溶酶体相关膜蛋白LAMP1反映了溶酶体完整性[25]， CathepsinB及LAMP1共同参与溶酶体降解过程，可以显示溶酶体功能的变化。而不溶性P62(Insouble)、泛素化蛋白Ubiquitin蛋白能反映自噬产物降解水平。上述自噬相关蛋白表达水平可以完整反映自噬与溶酶体清除之间的动态平衡情况，是判断自噬流是否通畅的依据。

本研究结果显示，与假手术组相比，模型组Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达上调，P62(Souble)表达下调，提示大鼠脑缺血14 d后，半影区自噬活性增强；且P62(Insouble)、Ubiquitin、CathepsinB、LAMP1表达显著上调，推断为应对脑缺血的发展，大量溶酶体标志物LAMP1及酸性水解酶蛋白CathepsinB活化，但也不能充分降解胞内大量异常积聚的自噬体和底物，导致底物P62(Insouble)及泛素化蛋白Ubiquitin在自噬下游堆积，阻碍自噬流通畅。提示自噬溶酶体清除障碍及缺陷导致大脑中动脉梗死大鼠脑中存在大量的自噬体和自噬溶酶体，故免疫荧光检测见大量LC3表达于Neun，且大鼠神经功能表现严重缺损及脑梗死体积显著增加。而魔呐奇组Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达下调，P62(Souble)表达有增高，免疫荧光可见定位于Neun的LC3占比减少，提示“魔呐奇”可抑制缺血半影区自噬活性； P62(Insouble)、Ubiquitin、CathepsinB、LAMP1表达显著下调，表明“魔呐奇”可减少自噬产物堆积，同时大鼠神经功能损伤显著逆转，脑梗死体积占比减少。

综上所述，持久的缺血损伤或高水平的自噬消耗引起溶酶体功能障碍及溶酶体活性不足，导致过量自噬体及底物在神经元中异常集聚，最终触发细胞死亡。故防止过量自噬体和底物的积累，保障自噬流通畅是一个潜在的治疗靶点，能有效改善缺血性损伤。“魔呐奇”可通过抑制皮质缺血半影区过度诱导的自噬流，保障自噬与溶酶体清除动态维稳，有效逆转缺血诱导的过量自噬产物滞留，促进自噬流通畅，从而显著逆转神经元损伤，发挥卒中后神经保护作用。最近一项研究表明过度的自噬可以通过溶酶体系统诱导细胞死亡，抑制自噬可以稳定溶酶体膜，从而阻断细胞凋亡信号通路，这揭示了缺血性脑卒中中自噬的“黑暗面”[26]。对于“魔呐奇”抑制缺血性脑卒中后自噬与凋亡之间的关系及对其神经元的最终影响有待深入研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。