安肠汤对正虚邪恋型溃疡性结肠炎大鼠miRNA-146a/IRAK-1/NF-κB信号通路的影响

梁运特，廖志远，赖斯华，张 琴，汤 勇，孙平良

(1. 广西中医药大学，广西 南宁 530200；2. 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

溃疡性结肠炎以反复腹泻、黏液脓血便为主要临床表现，多伴腹痛及不同程度的全身症状，具有病程漫长、易反复发作以及治愈难度大等特点。近年来的研究表明，溃疡性结肠炎多与遗传因素、免疫异常[1]、肠道微生态紊乱[2-3]有关。本课题组前期研究表明，安肠汤能够调节溃疡性结肠炎大鼠肠道菌群，降低肠道乙酸及血清内毒素含量，维持大鼠肠道内环境稳态，促进溃疡性结肠炎的愈合[4-5]。其治疗机制是否与miRNA-146a/IRAK-1/NF-κB信号轴相关，目前尚无相关报道。因此，本研究通过观察溃疡性结肠炎大鼠血浆中miRNA-146a表达量及结肠组织中miRNA-146a/IRAK-1/NF-κB信号轴中关键蛋白IRAK-1、NF-κB蛋白表达量，旨在阐明安肠汤基于miRNA-146a/IRAK-1/NF-κB信号轴修复受损肠黏膜治疗溃疡性结肠炎的机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康SPF级SD大鼠60只，雄雌各半，体重180～220 g，购自长沙天勤生物技术有限公司，许可证号:SCXK(湘)2014-0011。饲养于广西中医药大学，许可证号:SYXK(桂)2010-0001；实验室温度20～23 ℃，湿度50%～60%。实验方案经广西中医药大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准[2013(KF)-E-003]。

1.2主要药物 安肠汤药物组成:补骨脂25 g、黄芪20 g、潞党参15 g、干姜10 g、炒白术10 g、白头翁15 g、茯苓15 g、槟榔15 g、黑顺片15 g、炒鸡内金10 g、薏苡仁10 g、广木香10 g、地榆15 g、赤芍15 g、延胡索10 g、炙甘草10 g。药材全部购自广东康美药业股份有限公司，按以上用量取药材洗净、自来水浸泡30 min，先煎黑顺片30 min，再加入其他药物，再继续煎煮30 min，每剂药水煎3次，浓缩后4 ℃保留备用。丽珠肠乐由珠海丽珠集团丽珠制药厂生产(国药准字S10960040，实验全程使用同一批次药品)。本次实验用药处方及用量全部经过广西中医药大学附属第一医院药学部审核。

1.3主要试剂及耗材 水合氯醛(成都市科龙化工试剂厂，批号:2013101801，250 g/瓶)；5%的2，4，6-三硝基苯磺酸液(南宁市托普邦生物科技有限公司，商品编号:P2297-10ML，10 mL/瓶)；甲醛(成都市科龙化工试剂厂，批号:20130817，500 mL/瓶)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(品牌：Takara，型号：RR047A)；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(品牌：Takara，型号：RR036A)；TriQuick Reagent(品牌：索莱宝，型号：R1100)；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(品牌：Takara，型号：RR082A)；TransScript®-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(品牌：全式金，型号：AU311)；0.2 mL荧光定量PCR透明八排管八连管盖(品牌：ABI，型号：4323032)。高效RIPA组织/细胞裂解液(品牌：Solarbio，型号：R0010)；蛋白酶抑制剂混合液(100xPIC)(品牌：Solarbio，型号：P6730)。

1.4主要实验仪器 组织匀浆机(品牌：IKA，T18型)；恒温金属浴锅(上海一恒，TU-100C)；普通离心机(上海卢湘仪，TD4)；Haier医用低温保存箱(青岛海尔特种电器，DW-86L728J)；超微量核酸检测仪(遂真，FC-1100)；Ariamx Real-Time PCR(Agilent Technologies，G8830-64001)；VeritiTM96-Well Thermal Cycler(Applied Biosystems®，4375786)；低温离心机(eppendorf，5418R)；制冰机(广西中医药大学第一附属医院医学生物实验室，SIM- F140AY65)；单道移液器(德国Eppendorf 公司，10/20/100/200/1 000 μL)；一次性使用真空采血管(江西精致科技有限公司，抗凝管EDTA-K2)；Thermo FisherUHPLC 3000液相色谱(美国赛默飞，Ulti Mate 3000) ；超声清洗机(郑州园田清洁设备有限公司)。电泳仪(Bio-Rad，PowerPac Basic)；蛋白转印模块(湿转)(Bio-Rad，Mini Trans-Blot Cell)。

1.5实验方法 随机选取SD大鼠15只作为空白组，其余45只大鼠参照文献[6-7]方法建立溃疡性结肠炎模型：在禁食不禁饮24 h后，用水合氯醛(浓度：10%，按大鼠体重0.3 mL/100 g计算用量)进行腹腔注射麻醉，将灌肠管缓慢深入距大鼠肛门约7 cm，注入2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)(按大鼠体重90 mg/kg计算用量)造模，待药液完全进入肠道后，将大鼠提尾倒立1 min，保证药液充分停留在结肠内。空白组大鼠注入等体积的生理盐水，操作完毕待大鼠清醒后自由饮食，自由进水。将造模成功大鼠随机分为模型组、丽珠肠乐组、安肠汤组，每组15只。丽珠肠乐组大鼠灌胃丽珠肠乐混悬液[0.5亿活菌/(mL·只)]，安肠汤组灌胃安肠汤5 mL/(kg·d)(按临床等效量的6倍)，空白组和模型组大鼠灌胃生理盐水3 mL/只，均连续灌胃14 d。

1.6标本采集与处理 灌胃14 d后，水合氯醛麻醉各组大鼠，立即剖腹取腹主动脉血5～7 mL，室温静置30 min，然后3 000 r/min(离心半径13.5 cm)离心15 min，分离血清，并于-20 ℃冰箱保存待测。取距离肛门约8 cm处结肠病变最明显的组织，以等渗生理盐水冲洗表面黏附的血液、粪便、分泌物等，清除干净后，切取病变明显结肠组织，其中一部分冻存于-80 ℃冰箱，另一部分固定于4%多聚甲醛中。

1.7观察指标及方法

1.7.1病理组织学观察 选取结肠组织的病变部位，待4%多聚甲醛固定24 h后，按梯度进行酒精脱水，浸蜡，组织切片，脱蜡，HE染色等，光镜下观察组织形态学改变，并拍照。

1.7.2血浆中miRNA-146a表达水平测定 采用定量聚合酶链反应(qPCR)方法检测：取0.3 mL血浆，放入2 mL离心管中置于冰盒上，加入1.2 mL TriQuick Reagent，混匀，室温静置5 min，加入0.3 mL氯仿，震荡机震荡15 s，静置2 min；4 ℃下12 000×g离心15 min，取上清0.6 mL加入洁净的1.5 mL离心管中；加入0.6 mL异丙醇，轻轻混匀，室温静置10 min；4 ℃下12 000 ×g离心10 min，弃上清；加入1 mL 75%酒精，轻轻洗涤沉淀，4 ℃下12 000 ×g离心5 min，弃上清；加入1 mL 75%酒精，轻轻洗涤沉淀，4 ℃下12 000 xg离心5 min，弃上清；加入1 mL无水乙醇，4 ℃下12 000 xg离心5 min，弃上清；65 ℃金属浴锅上烘干沉淀，加0.03 mL DEPC水溶解。使用超微量核酸检测仪(遂真，FC-1100)进行RNA浓度及纯度检测，后按照反转录试剂盒说明书(全式金AU311)进行反转录操作，所得cDNA置于-80 ℃保存待用。qPCR反应体系：MonAmpTMSYBR®Green qPCR Mix 10 μL，cDNA 1 μL，Primer Forward(10 μmol/L)0.4 μL，Primer Reverse(10 μmol/L)0.4 μL，H2O 8.2 μL；反应程序：预变性95 ℃ 30 s；PCR循环(40循环)：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s。实验仪器为Agilent Technologies AriaMx Real-Time PCR仪。miR-146a-F引物序列：GGGACCTGTGAAGTTCAGTT。经实验获得的数据使用SPSS软件进行整理及分析，采用2-ΔΔCT法进行分析，公式：ΔCt=(Ct gene-Ct β-actin),ΔΔCt= (ΔCt treat-ΔCt control)。所得数据使用GraphPad进行整理制图。

1.7.3结肠组织中IRAK-1、NF-κb蛋白表达检测 采用Western blot法检测：取20～40 mg剪成细小碎片的结肠组织，放入2 mL离心管中置于冰盒上，加入200～400 μL RIPA-PMSF-PIC，用匀浆机匀浆至无沉淀，匀浆时匀浆5 s左右放回冰盒冷却一会儿再继续匀浆。12 000 r/min离心(离心半径13.5 cm)5 min，取上清采用BCA法测定蛋白含量。将浓度定量至2 μg/μL，加入4×蛋白上样buffer，100 ℃变性10 min。所得变性后的蛋白置于-80 ℃保存待用。90 V恒压电泳约20 min，待样品进入分离胶层后，换用120 V恒压电泳1～1.5 h。300 mA恒流转膜90 min。用TBST(索莱宝，T1081)配制8%脱脂奶粉(索莱宝，D8340)作为封闭液，将膜放入封闭液中封闭3 h。按抗体说明书上的推荐比例使用封闭液将一抗进行稀释，将膜放入稀释后的一抗中4 ℃孵育12 h。一抗孵育完成后，使用TBST洗膜3次，每次15 min。将膜放入按1∶4 000比例稀释的二抗(goat anti-rabbit:Abcam, ab6721)中37 ℃ 孵育1 h，使用TBST洗膜3次，每次15 min。使用ECL显色剂对膜进行显色，于凝胶成像仪中进行曝光成像。

2 结 果

2.1各组大鼠结肠组织病理表现 空白组大鼠结肠组织结构正常，腺体排列整齐，黏膜上皮组织完整，黏液层光滑；模型组大鼠肠组织结构异常，黏膜表面出现缺损，黏液层部分丢失，大量炎细胞聚集、浸润，腺体破坏甚至丢失；丽珠肠乐组大鼠结肠组织结构部分紊乱，黏膜缺损较模型组轻，部分腺体遭到破坏，炎细胞较模型组少；安肠汤组大鼠结肠组织结构基本正常，黏膜缺损轻，受损部位可见少量炎症细胞。见图1。

图1 各组大鼠结肠组织HE染色病理表现(×100)

2.2各组大鼠血浆中miRNA-146a相对表达量比较 空白组、模型组、丽珠肠乐组、安肠汤组大鼠血浆中miRNA-146a相对表达量分别为1.05±0.34，2.01±0.58，1.34±0.25，1.12±0.12，模型组明显高于空白组(P<0.05)，丽珠肠乐组和安肠汤组明显低于模型组(P均<0.05)，安肠汤组明显低于丽珠肠乐组(P<0.05)。

2.3各组大鼠结肠组织中IRAK-1、NF-κB蛋白表达量比较 模型组大鼠结肠组织中IRAK-1、NF-κB蛋白相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05)，丽珠肠乐组和安肠汤组均明显低于模型组(P均<0.05)，安肠汤组明显低于丽珠肠乐组(P均<0.05) 。见表1及图2。

图2 Western blot 检测各组大鼠结肠组织中IRAK-1、NF-κB蛋白表达情况

表1 各组大鼠结肠组织中IRAK-1、NF-κB蛋白相对表达量比较

2.4各组大鼠血清 TNF-α、IL-10、IL-17水平比较 模型组大鼠血清中 TNF-α、IL-10、IL-17水平均明显高于空白组(P均<0.05)。丽珠肠乐组和安肠汤组大鼠血清中 TNF-α 、IL-17水平均明显低于模型组(P均<0.05)，但安肠汤组明显高于丽珠肠乐组(P均<0.05)；丽珠肠乐组和安肠汤组大鼠血清中IL-10水平明显高于模型组(P均<0.05)，且安肠汤组明显高于丽珠肠乐组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清 TNF-α、IL-10、IL-17水平比较

3 讨 论

溃疡性结肠炎在美、欧等发达国家的发病率较高，近年来我国患病率也逐年上升。据调查，我国的溃疡性结肠炎患病率为11.6/10万[8]。目前临床治疗溃疡性结肠炎的药物很多，但都存在不同程度的不良反应。如长期服用氨基水杨酸药物会引起恶心、腹泻、腹痛、胃烧灼感、纳差、腹胀等胃肠道反应，甚至出现白细胞减少、血小板减少、中性粒细胞减少、急性和慢性胰腺炎、肝炎、心包炎等严重的不良反应[9]。长期应用糖皮质激素可引起机体内电解质、糖类、蛋白质及脂肪的代谢紊乱，且有向心性肥胖、满月面、水牛背等风险，甚者会引起高血压、消化道溃疡、免疫力下降等。免疫抑制剂的常见不良反应主要是骨髓抑制，表现为白细胞和血小板减少，也会引起胃肠道症状、泌尿生殖系统症状。生物制剂如英夫利西单克隆抗体的不良反应主要是感染，其次是提高肿瘤及充血性心力衰竭发生风险。

中医药治疗慢性反复发作的溃疡性结肠炎，可对患者机体进行整体调节，特别是对免疫系统具有双重调节作用。安肠汤是全国名老中医药专家学术经验继承工作指导老师、广西名老中医肖振球教授治疗溃疡性结肠炎的经验方。肖老认为溃疡性结肠炎当属中医“痢疾”范畴，以脾肾阳虚为本，湿、毒、瘀为标，寒湿停滞肠腑，郁而化热，致脂膜损伤、络破血溢所引起，强调正虚是发病之根本。治疗上以温补脾肾、行气祛湿为法，从而创制了安肠汤。为进一步阐明安肠汤改善溃疡性结肠炎炎性病变的分子机制，本实验观察了安肠汤对溃疡性结肠炎大鼠miRNA-146a/ IRAK-1/NF-κB 信号通路中关键蛋白表达的影响。

MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码、长度为20～24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用，可通过调控炎症因子和免疫细胞的作用参与炎症发生，如炎症细胞受到某种刺激后会导致miRNA向上或向下调节，从而影响多种生物功能，起到促进炎症或抗炎的双向调节作用[10-12]。殷媛等[13]研究表明炎症相关miR-146a和癌症相关miR-27a、miR-29a、miR-20a、miR-21在溃疡性结肠炎、克罗恩病和肠炎相关结直肠癌中的表达都显著高于正常结肠组织，且这一组mi RNA的靶基因都富集在癌症相关通路、免疫信号相关通路和炎癌转换相关通路上。周毅骏等[14]报道，雷公藤多苷片能通过抑制mi R-146a和mi R-146b的表达和抑制TLR4/My D88依赖信号通路及炎症因子IL-1β、TNF-α释放而减轻溃疡性结肠炎病情。由此可见，miRNA-146a是炎症过程中重要的调控基因，是促进结肠黏膜修复的关键因素，且与炎症相关信号通路关系密切，这为研究安肠汤促进受损肠黏膜的修复治疗溃疡性结肠炎提供了思路。

NF-κB介导是炎症反应中的经典信号通路[15-17]，静息状态下以NF-κB二聚体与IκB结合，此时并无生物学活性，当机体受到应激、炎症、细胞因子等多种因素刺激时， IκB激酶(IKK) 复合物被激活降解，释放出NF-κB，激活后具有活性的NF-κB进入细胞核内与κB位点序列特异性结合，导致促炎性因子如IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ等的过表达，使炎症反应得以放大和持续，最终导致溃疡性结肠炎的发生[18]。顾思臻等[19]认为溃结通治疗溃疡性结肠炎可能是通过阻断NF-κB经典炎症通路的活化起到抗炎作用。张镖等[20]研究表明别旁茶苷能通过激活PXR、CYP3A等因子，抑制NF-κB的表达，从而降低结肠组织中炎症因子 TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1的表达水平。

IL-1受体相关激酶(IRAK)家族包括IRAK-1、IRAK-2、IRAK-3和IRAK-4，均含死亡结构域(DD)，参与机体的炎症反应过程[21-23]。如IRAK-1分子被激活后，可通过NF-κB信号通路参与细胞增殖、凋亡和侵袭等生物行为[24]。Cheng等[25]研究发现IRAK-1通过AP-1/AKR1B10信号通路在肝细胞癌中增强癌症的抵抗力和耐药性。IL-17主要是由Th17细胞分泌的细胞因子，在炎症性疾病、过敏性疾病、自身免疫性疾病等多种疾病中发挥作用。IL-10是多源细胞因子，主要由肠道的T细胞、B细胞和巨噬细胞分泌。全基因组关联研究(GWAS)表明，IL-10或IL-10R等位基因突变与溃疡性结肠炎的发生密切相关，可见IL-10在抗溃疡性结肠炎治疗中的重要作用[26]。

本实验结果显示，丽珠肠乐组、安肠汤组miRNA-146a相对表达量和结肠组织中IRAK-1、NF-κB蛋白表达量均明显低于模型组，且安肠汤组明显低于丽珠肠乐组，提示丽珠肠乐和安肠汤均可抑制miRNA-146a及IRAK-1、NF-κB蛋白的表达，安肠汤的抑制作用好于丽珠肠乐。同时丽珠肠乐组及安肠汤组大鼠血清中TNF-α、IL-17水平均明显低于模型组，而丽珠肠乐组均明显低于安肠汤组；丽珠肠乐组和安肠汤组大鼠血清中IL-10水平明显高于模型组，且安肠汤组明显高于丽珠肠乐组。提示丽珠肠乐和安肠汤都能够抑制该信号通路末端炎症因子的表达，丽珠肠乐的作用优于安肠汤，但安肠汤上调IL-10的作用优于丽珠肠乐。

综上所述，推测安肠汤能够通过miRNA-146a调控IRAK-1/NF-κB信号通路，控制溃疡性结肠炎的炎症活动，从而修复受损肠黏膜。安肠汤是复方中药，特别是煎煮过后汤剂中化学成分更为复杂，其确切的抗溃疡性结肠炎组分及详细的作用机制尚有待于进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。