葛芩止痢颗粒药效学试验

陈鹏举，焦文强，邢广旭，史迎迎，陆凤琪，陈文成，张钧杰，郭腾达，张光辉

(1. 河南省现代中兽医研究院，河南 郑州 450002 ； 2. 河南农业大学，河南 郑州 450002 ；3. 河南省农业科学院，河南 郑州 450002 ； 4. 安徽牧春堂天然药物研究开发有限公司，安徽 滁州 239000)

仔猪腹泻(Piglet diarrhea)是生猪养殖过程中一类常见疫病，发病率高、控制难度大，引起仔猪腹泻的病因复杂多样，多因病原微生物感染、断奶时应激反应等引起肠道紊乱，进而使体内外出现炎症。仔猪发病后难以治愈，直接导致成活率下降、饲料转化率低，导致仔猪自身免疫功能受到影响，继发其他类型的疾病而导致死亡[1-6]。本课题组在葛根芩连汤的基础上研制了葛芩止痢颗粒，该处方来源于对《伤寒论》中葛根芩连汤的加减，具有解热抑菌、抗病毒、减缓小肠推进率、抑制胃肠运动及增强机体免疫功能等作用。该方剂中葛根能够解痉舒肌，缓解腹泻引起的腹痛； 甘草具有抗炎、舒缓胃肠平滑肌痉挛的功能； 杨树花体外对大肠埃希菌具有明显的抑制作用；而中药单体化合物黄芩苷及小檗碱具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗菌痢等作用，临床上用于治疗仔猪白痢。本试验对葛芩止痢颗粒进行临床前药效学研究，考察其功效及适用范围，为进一步的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物 葛芩止痢颗粒，由滁州市安徽牧春堂天然药物研究开发有限公司中试生产，规格：每1 g 相当于原生药材为0.92 g；盐酸小檗碱片，购自东北制药集团沈阳第一制药有限公司，规格：0.1 g/片；布洛芬缓释胶囊，购自中美天津史克制药有限公司，规格：0.4 g；注射用青霉素钠，规格：0.48 g(80万单位)， 购自哈药集团制药总厂；硫酸黏菌素，购自上海诺华药业有限公司。营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、改良马丁氏琼脂、马丁肉汤培养基，均购自北京中海生物科技有限公司；其余化学试剂为分析纯。

1.2 试验菌种 大肠埃希菌O8、猪霍乱沙门菌C78-4、金黄色葡萄球菌C56023，以上菌种均来源于中国兽医菌种保藏中心。

1.3 实验动物 健康清洁级昆明小鼠，雌雄各半，体重20～25 g，购自广西医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证：SCXK桂2014—0002，在新环境中适应饲养7 d。灌胃前禁食8～12 h，不限制饮水。

1.4 试验仪器 恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂)，无菌操作台(荣事达有限公司)，电子分析天平(上海菁华仪器公司)，其他为实验室常规仪器设备。

1.5 试验方法

1.5.1 葛芩止痢颗粒对猪源病原菌的体外抑菌作用 采用微量肉汤稀释法探究葛芩止痢颗粒的体外抑菌作用。将葛芩止痢颗粒用10%二甲基亚砜溶液配成每1 mL含原生药材量0.92 g的溶液，过滤除菌后置于4 ℃中保存，备用。将保藏菌种取出后，进行复苏培养，将菌液浓度校正至0.5麦氏比后，用营养肉汤稀释成105CFU/mL作为供试菌液。取96孔板每隔1行标号A/B/C，在A/B/C三行的全部孔中加配好的液体培养基50 μL，再在A/B/C每行的第1个孔中加入50 μL供试药液，使药物与培养基充分混匀，从第1孔中取50 μL加入第2孔，进行倍比稀释至第9孔，弃去50 μL。第10孔为200 U/mL青霉素钠或5 μg/mL的硫酸黏菌素阳性对照组。然后在A/B/C每行的第1～11个孔中加入50 μL供试菌液，第12个孔中加入50 μL液体培养基，作为阴性对照组。加完后用保鲜膜盖住，置于37 ℃恒温培养箱中培养18～20 h后，每组重复3次，观察结果。

1.5.2 葛芩止痢颗粒对大肠埃希菌感染小鼠的保护作用 预试验将大肠埃希菌菌液(浓度为7.6×1010CFU/mL)用无菌生理盐水依次稀释为1010、109、108、107、106五个浓度。取昆明小鼠25只，随机分为5组，每组5只，分别腹腔注射不同浓度的菌液0.5 mL/只，观察攻毒4 d内各组小鼠死亡情况，以确定小鼠约80%死亡的大肠埃希菌菌液浓度。经过预试验得出引起小鼠80%死亡的菌液浓度为7.6× 109CFU/mL。取昆明小鼠75只，随机分为5组，每组15只，雌雄各半，分别为葛芩止痢颗粒(高、中、低)剂量组，阳性(硫酸黏菌素)对照组和感染对照组。葛芩止痢颗粒(高、中、低)剂量组分别按9 、6 g/(kg·bw)和4 g/(kg·bw) 灌胃给药，阳性对照组按100 mg/(kg·bw) 腹腔注射硫酸黏菌素，将硫酸黏菌素以无菌生理盐水溶解，感染对照组灌服清水，灌胃剂量为0.2 mL/(10 g·bw)，各组小鼠每天给药1次，连续给药5 d。第3天给药后，各组小鼠腹腔注射7.6×109CFU/mL大肠埃希菌菌液，体积为0.5 mL/只，观察5 d内各组小鼠死亡数。

1.5.3 葛芩止痢颗粒对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 昆明小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半，分别为葛芩止痢颗粒(高、中、低)剂量组，阳性(布洛芬)对照组和感染对照组。葛芩止痢颗粒(高、中、低)剂量组分别按9、6 g/(kg·bw)和4 g/(kg·bw) 灌胃给药，阳性对照组按150 mg/(kg·bw) 灌服布洛芬，布洛芬缓释胶囊用纯净水溶解，感染对照组灌服清水，灌胃剂量为0.2 mL/(10 g·bw)， 各组小鼠每天给药1次，连续给药5 d。末 次给药30 min后，每组小鼠右耳双面涂以二甲苯30 μL，左耳不涂作为自身对照，30 min后颈椎脱臼处死，立即沿耳廓基线剪下双耳，用直径6 mm打孔器分别于左右两耳相同部位取耳片，精密称重。计算耳肿胀度和肿胀抑制率。

肿胀度=右耳片质量-左耳片质量

肿胀抑制率=(感染对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/感染对照组平均肿胀度×100%

1.5.4 葛芩止痢颗粒对蓖麻油引起的小鼠腹泻作用的影响 昆明小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半，分别为葛芩止痢颗粒(高、中、低)剂量组，阳性(盐酸小檗碱)对照组和感染对照组。葛芩止痢颗粒(高、中、低)剂量组分别按9、6 g/(kg·bw)和4 g/(kg·bw)灌胃给药，阳性对照组按150 mg/(kg·bw)灌服盐酸小檗碱，盐酸小檗碱片用纯净水溶解，感染对照组灌服清水，灌胃剂量为0.2 mL/(10 g·bw)。各组小鼠灌胃蓖麻油，体积为0.1 mL/(10 g·bw)，30 min后灌胃给药，然后把小鼠单个放在垫有吸水纸的鼠笼内，每隔1 h更换垫纸，记录小鼠排稀粪点数，观察6 h，比较组间不同时间累积腹泻次数(稀粪点数)。

1.6 统计分析 利用SPSS Statistics18.0软件，对试验数据进行统计分析，通过t检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 葛芩止痢颗粒对猪致病菌的体外抑菌作用 结果由表1可知，葛芩止痢颗粒对3种猪致病菌最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)分别为大肠埃希菌(MIC=14.37 mg/mL)，猪霍乱沙门菌(MIC=28.75 mg/mL)，金黄色葡萄球菌(MIC=14.37 mg/mL)，结果表明，葛芩止痢颗粒对猪大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的体外抑菌作用最强，对猪霍乱沙门菌体外抑菌作用较弱。

表1 葛芩止痢颗粒对猪常见致病菌的抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of Geqinzhili granules against porcine common pathogenic bacteria

2.2 葛芩止痢颗粒对大肠埃希菌感染小鼠的保护作用 结果由表2可知，葛芩止痢颗粒可以降低腹腔感染大肠埃希菌小鼠的死亡数，且存在剂量依赖性，高剂量组的保护率为80.00%，中剂量组的保护率为73.33%，低剂量组的保护率为60.00%，硫酸黏菌素组的保护率为86.67%，而感染对照组的存活率仅为26.67%。葛芩止痢颗粒高剂量组与感染对照组比较，差异极显著(P<0.01)，中剂量组与感染对照组比较，差异显著(P<0.05)，但其对小鼠的保护效率略弱于硫酸黏菌素组。

表2 葛芩止痢颗粒对腹腔感染大肠埃希菌小鼠的保护作用Table 2 Protective effect of Geqinzhili granules on murine intra-abdominal infection with Escherichia coli

2.3 葛芩止痢颗粒对二甲苯所致小鼠耳肿胀的抗炎作用 结果由表3可知，葛芩止痢颗粒对二甲苯致小鼠的耳肿胀与感染对照组相比有明显的抑制作用(P<0.01)，且与剂量呈现出正相关性，即随着剂量的提高其耳肿胀越小，抑制率越高，肿胀度和肿胀抑制率分别为低剂量组(8.62±2.18) mg、34.79%，中剂量组(7.48±1.93) mg、43.42%，高剂量组(6.50±2.20) mg、50.83%。葛芩止痢颗粒高、中、低剂量组均能显著抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀(P<0.01)， 但其抗炎效果均略弱于布洛芬组，但与感染对照组相比仍然体现出明显的耳肿胀抑制作用。

表3 葛芩止痢颗粒对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响Table 3 Effect of Geqinzhili granules on xylene-induced ear edema in mice

2.4 葛芩止痢颗粒对蓖麻油引起的小鼠腹泻的止泻作用 由表4可知，葛芩止痢颗粒与感染对照组相比可明显降低蓖麻油引起的小鼠腹泻次数，尤其是葛芩止痢颗粒的高、中剂量组的止泻效果极显著高于感染对照组(P<0.01)，低剂量组的止泻效果稍弱但也显著高于感染对照组(P<0.05)。同时，随着时间的变化，葛芩止痢颗粒高、中剂量组的止痢效果与盐酸小檗碱组的效果差异度较小，药效基本一致，且均极显著高于感染对照组(P<0.01)，低剂量组的效果要弱于盐酸小檗碱组的止痢效果，但其止痢效果仍然显著高于感染对照组(P<0.05)。

表4 葛芩止痢颗粒对蓖麻油引起小鼠腹泻的影响Table 4 Effect of Geqinzhili granules on castor oil-induced diarrhea in mice

3 讨论

腹泻是家畜养殖中常见的临床症状，尤其以仔猪腹泻最为严重，引起腹泻的病因很多，其中以肠道感染、炎症和肠道功能紊乱最为常见。葛芩止痢颗粒处方来源于实践经验，是在深入研究传统治疗腹泻中药复方药物组成的基础上，通过对仔猪白痢临床症状进行辩证分析，以中兽医理论为指导，根据“君臣佐使”的组方原则和配伍特点自拟的新组方。葛根有解肌退热，生津止渴，升阳止泻之功，常用于表证发热，热泻热痢，脾虚泄泻，解痉舒肌，缓解腹泻引起的腹痛[7]。黄芩是传统常用中药，可清热燥湿、凉血解毒、泻火安胎等[8]，其主要的黄酮类成分黄芩素和黄芩苷，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝等活性[9-11]。黄连中的小檗碱具有广谱的抗菌活性，它作为传统中药主要用于菌痢、胃肠炎、痈肿等细菌性感染疾病[12]；甘草具有抗炎、舒缓胃肠平滑肌痉挛的功能；杨树花体外对大肠埃希菌具有明显的抑制作用，体内对小鼠感染大肠埃希菌有显著抑制作用，且具有良好的抗炎效果[13]。煨葛根配黄芩、黄连具有清热、利湿、解毒；葛根煨用减其发散之力，专入阳明之里，生发清阳之气以生津止泻，防芩连苦寒伤阴之弊；而黄芩、黄连清热除湿解毒之功效，配合炙甘草调和药性，达到止泻、消炎、抗菌的作用[14]。

本试验表明，葛芩止痢颗粒对猪病原菌具有体外抑制作用，同时对腹腔感染大肠埃希菌的小鼠有保护作用，对二甲苯致小鼠的耳肿胀具有抑制作用，对蓖麻油诱导的小鼠腹泻具有良好的止泻作用。综上所述，葛芩止痢颗粒具有抗菌、抗炎、止泻的作用。