纸片协同试验用于肠杆菌科细菌碳青霉烯酶检测的价值

张逸 朱钱迎 张青 陈霜 夏菲 戴其锋 钱定良

碳青霉烯酶是指可以水解碳青霉烯类抗菌药物如美罗培南（MEM）和亚胺培南的一类β-内酰氨酶，它包括Ambler分子结构分类的A、B、D三类酶。其中A类酶、D类酶为丝氨酸酶，B类酶为金属酶，A类酶的活性可以被硼酸类化合物所抑制；B类酶分布广泛，活性可被乙二胺四乙酸钠（EDTA）所抑制；D类酶主要为OXA型碳青霉烯酶[1]，其活性不被酶抑制剂和EDTA抑制。近年来，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）遍布全球，由于逐年升高的检出率和高归因死亡率，已构成了重大的公共卫生威胁[2]。CRE对碳青霉烯类药物的耐药机制分为两类：一为产碳青霉烯酶，二为一些非产酶的机制，产碳青霉烯酶是CRE最常见的耐药机制，且已有文献证实产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌（carbapenemase-producing Enterobacteriaceae，CPE）比非产碳霉烯酶肠杆菌科细菌毒性大、预后差、易传播且病死率高[3]，因此，临床需要一种快速、准确的方法来检测碳青霉烯酶并区分类型而指导临床用药。本研究参考2017年欧洲药敏试验委员会（EUCAST）推荐的碳青霉烯酶表型检测试验，以PCR耐药基因序列分析为金标准，评估纸片协同试验用于CPE检测的价值。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 收集2015年1月至2018年12月瑞安市人民医院从各种临床标本中分离非重复送检的可疑CPE共75株，其中肺炎克雷伯菌51株，大肠埃希菌17株，阴沟肠杆菌3株，霍氏肠杆菌1株，产气肠杆菌1株，产酸克雷伯菌1株，布氏柠檬酸杆菌1株；来自血液24株（32.0%），尿液20株（26.7%），痰液12株（16.0%），其他无菌体液胸腹水、胆汁、分泌物等19株（25.3%）。来自男性患者54株（占72.0%），女性患者21株（占28.0%），患者平均年龄64岁。同时选取非CPE 10株作为阴性对照组。

1.2 主要试剂与仪器 Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定药敏仪、Vitek-MS及其配套板卡购自法国生物梅里埃公司；PCR扩增仪、凝胶成像仪和电泳仪购自美国Bio-Rad公司；PCR扩增试剂盒购自上海生工生物有限公司；2×Taq Master Mix及DNA marker购自上海生工生物有限公司；50×TAE、琼脂糖、GoldViewTM核酸染料购自上海赛百威基因技术有限公司；苯基硼酸（PBA）购自美国Sigma公司；氯唑西林购自上海抚生实业有限公司；EDTA购自上海生工生物有限公司；MEM纸片（10 μg）、哌拉西林-他唑巴坦（TZP）纸片（110 μg）购自英国Oxid公司；替莫西林纸片（30 μg）购自意大利Liofilchem公司；哥伦比亚血琼脂平板、M-H培养基购自广州迪景微生物科技有限公司；引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 菌株筛选、鉴定及药敏 将收集到的菌株进行MEM、TZP纸片扩散法，药敏结果参照CLSI2017年标准。根据EUCAST指南，MEM抑菌圈直径＜28 mm（除外25～27 mm且TZP敏感或中介）为可疑CPE（流程见图1）。所有筛选出的CPE菌株均采用法国梅里埃公司ViteK MS质谱仪进行菌株鉴定并采用Vitek2 Compact微生物分析仪进行药敏试验。药敏试验所用质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，由中国疾病预防控制中心提供。

图1 CPE检测流程图（1：没有协同，也可能是菌株体内存在几种碳青霉烯酶，此时需要分子方法；2：MBL为B类金属酶；3：替莫西林高水平耐药是MIC＞128 mg/L，或抑菌圈≤10 mm。这是OXA-48的表型标志；4：R代表耐药；5：S代表敏感）

1.3.2 碳青霉烯酶耐药基因的检测 35℃培养24 h复苏待测菌株，用煮沸法提取细菌基因组DNA待用。采用PCR扩增法扩增碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaVIM、blaIMP、blaNDM-1、blaOXA-48）、ESBL 基因 （blaCTXM-1、blaCTX-M-9）、AmpC 酶基因（blaDHA、blaEBC）。所用引物序列及退火温度见表1。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统成像并记录。

表1 耐药基因PCR引物

1.3.3 碳青霉烯酶表型确认试验

1.3.3.1 抑制剂纸片的制备 用打孔器制作直径6 mm的圆形滤纸，分装、高压灭菌备用。取PBA 60 mg溶解于1.5 ml的二甲基亚砜中，加入1.5 ml蒸馏水，配成20 mg/ml的溶液[4]；取氯唑西林75 mg溶解于1 ml蒸馏水中，配成75 mg/ml的溶液[5]；称取3.72 g EDTA-Na2加入200 ml的干净烧杯中，加入75 ml蒸馏水，边搅拌边用氢氧化钠调pH至8.0，定容至1 000 ml，配成浓度为0.1 mmol/L的溶液[6]，配置完成后，均高压灭菌后备用。将20 mg/ml PBA、75 mg/ml氯唑西林、0.1 mmol/L EDTA各取10 μl分别滴加于空白纸片制成抑制剂纸片，干燥30、60 min内使用。

1.3.3.2 纸片协同试验 根据CLSI指南进行纸片药敏试验，挑取血平皿上35℃培养18～24 h的待测菌落，用无菌生理盐水制备成0.5麦氏浊度的菌悬液；将菌悬液均匀涂布于MH琼脂平皿上，静置10 min待干燥；每个接种受试菌的MH平板平均分成两部分，其中一部分贴上MEM纸片，在MEM纸片左右两侧贴上PBA、氯唑西林纸片，与MEM纸片距离均为1～2 cm，另一部分MEM纸片周边贴EDTA纸片，与MEM纸片距离为1～2 cm；当结果显示PBA和EDTA协同试验均无协同作用时，再进行替莫西林纸片扩散法。MEM抑菌圈靠近抑制剂纸片一侧明显扩大者为阳性，协同试验的结果判读标准见表2。

表2 PBA、氯唑西林、EDTA协同试验和替莫西林纸片扩散结果判定

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。以PCR结果为金标准，计算PBA协同试验、EDTA协同试验检测碳青霉烯酶的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值，分别与基因检测结果进行Kappa一致性检验分析：Kappa值＞0.75，说明两种方法诊断结果一致性较好；Kappa值在0.4～0.75，说明一致性一般；Kappa值＜0.4，说明一致性较差。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株药敏试验结果 可疑CPE对大部分β-内酰胺类药物呈高度耐药，耐药率接近100.0%，对阿米卡星的耐药率为48.0%。不同菌属中CPE菌株对不同抗菌药物的耐药率见表3。10株非CPE中大肠埃希菌8株，阴沟肠肝菌2株，对亚胺培南均敏感，对厄他培南的耐药率为30.0%。

表3 75株可疑CPE对抗菌药物的耐药率（%）

2.2 耐药基因的检测结果 75株可疑CPE经PCR扩增，共检出66株产碳青霉烯酶（其中产KPC 46株，产NDM-1 18株，产IMP 1株，产VIM 1株，无产OXA-48基因型），6株产超广谱 β-内酰胺酶（ESBLs）（CTX-M-1 1株，CTX-M-1+CTX-M-1 2株，CTX-M-9 3株），3株未检测出基因。部分电泳结果见图2-3；10株非CPE均未检出碳青霉烯酶耐药基因。

图2 NDM-1和KPC基因部分电泳图（M为分子量标准，7、14分别为NDM-1和KPC基因的阳性对照，6、13分别为NDM-1和KPC基因的阴性对照）

图3 VIM和IMP基因部分电泳图（M为分子量标准，7、14分别为VIM和IMP基因的阳性对照，6、13分别为VIM和IMP基因的阴性对照）

2.3 纸片协同试验检测结果 依据上述方法中介绍的判定依据，纸片协同试验部分结果见图4，性能评价见表4～6。PBA协同试验阳性菌株有48株，氯唑西林协同均阴性，结合PCR的结果有1株阴沟肠杆菌和1株大肠埃希菌未检测出耐药基因，结果显示假阳性。对KPC碳青霉烯酶的检测，PBA协同试验灵敏度为100.0%（46/46），特异度为93.1%（27/29），准确度为97.3%（73/75），阳性预测值为 95.8%（46/48），阴性预测值为100.0%（27/27），Kappa值为 0.943（P＜0.001），提示与基因检测结果一致性高。对于B类碳青霉烯酶的检测，EDTA协同试验阳性菌株有20株，PCR结果也为20株，灵敏度和特异度均为100.0%，准确度为100.0%，阳性预测值为100.0%，阴性预测值为100.0%，Kappa值为1（P＜0.001），与基因检测结果一致性较好。10株非CPE中，纸片协同试验均阴性。

表4 PBA协同试验检测肠杆菌科KPC型碳青霉烯酶（株）

表5 EDTA协同试验检测肠肝菌科MBL（株）

表6 纸片协同试验用于CPE检测的整体性能评价

图4 纸片协同试验表型结果（a：产NDM-1型大肠埃希菌；b：产KPC型肺炎克雷伯菌；c：产CTX-M型大肠埃希菌）

3 讨论

自1993年首次在阴沟肠杆菌科细菌中发现由染色体编码的NmcA碳青霉烯酶以来，CRE在世界范围内广泛出现，其主要机制是产碳青霉烯酶，这种酶现多由质粒介导，容易在细菌间传播[7]。CPE的流行传播给临床治疗和感染控制带来极大的挑战，故快速准确检测CPE对有效控制感染、预防产酶菌株传播有重要的价值。基于PCR检测方法成本高，操作复杂及需要专业的仪器和技术人员，更重要的是，该法无法检测出新的碳青霉烯酶基因，故临床应用受到限制。本研究采用碳青霉烯酶表型检测方法，该法操作简便、成本低且能够有效地区分不同类型的碳青霉烯酶，可以更好地指导临床对抗菌药物的选择，对临床治疗和感染控制具有重大意义。

PBA和氨基苯硼酸（APBA）协同试验均能检测出产A类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌，但有研究表明PBA对产KPC等A类酶的检测性能要优于APBA[8]。本研究使用200 μg PBA进行PBA协同试验，可检测出所有产KPC肠肝菌科细菌，灵敏度达100.0%，有2株分离菌株出现假阳性结果，可能与试验只扩增了KPC基因，并未对其他A类碳青霉烯酶如GES、IMI、SIM等进行研究有关。此外PBA协同试验在产AmpC合并孔蛋白缺失菌株中也能出现阳性，有研究表明，使用氯唑西林（AmpC酶抑制剂）可区分两者[7-9]。

对于产MBL（即B类金属酶）肠肝菌科细菌，EDTA协同试验灵敏度和特异度均达到100.0%，这与Teethaisong等[10]研究结果一致。Giske等[11]研究发现吡啶二羧酸对产MBL肺炎克雷伯菌的检测特异度要高于EDTA，灵敏度相似，本研究中EDTA协同试验特异度达100.0%，但本研究的阳性例数不多，在今后还将继续研究。此外，有研究报道纸片协同试验对于检测同时存在KPC和MBL的菌株，结果会出现假阴性，只有在纸片上同时滴加PBA和EDTA时才出现阳性结果[12]，但由于本研究收集的菌株均为单个产KPC或MBL，所以对该结论还有待进一步研究。

有研究报道替莫西林抑菌圈直径≤10 mm且MEM与EDTA或PBA无协同作用可检测出所有产OXA-48肠杆菌科细菌，灵敏度和特异度均达100.0%[10，13]。本研究所收集的75株肠杆菌科细菌均未检测到OXA-48，主要是因为这类碳青霉烯酶在国内非常罕见，迄今为止，中国所报道OXA阳性的CRE不到50株[14-15]。故无法对该方法进行评价。

协同试验与目前微生物实验室常用的改良Hodge试验相比，特异度更高，研究指出改良Hodge试验对高产Ampc酶或CTX-M类型ESBL的肠肝菌科细菌容易产生假阳性[15-17]；与Carba NP、mCIM及MALDI-TOF质谱分析法相比，灵敏度和特异度相差不大。但目前没有可用的表型检测方法被证明是完全具有灵敏度和特异度[18]，要根据每个实验室的流行病学情况和可用资源选择合适的方法。

综上所述，PBA和EDTA协同试验对于检测产A类和B类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌来说是一种方便、经济、准确的表型确认试验，并且操作简便、成本低，适合在临床微生物学实验室、医院感染管理科及疾病预防控制中心等单位普及应用。